المشبك قوة رهيوميتري لوصف الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين
Summary
يتم استخدام تقنية رهيوميتري المشبك قوة جديدة للتحقيق في الخواص الميكانيكية لعينات صغيرة الحجم على أساس البروتين المائية المربوطة بين لفائف صوت محرك، وجهاز استشعار قوة. نظام (PID) نسبي-متكاملة-مشتقات تناظرية يسمح ‘لقط’ قوة ذوي الخبرة إلى البروتوكول المطلوب.
Abstract
هنا، يمكننا وصف أسلوب رهيوميتري قوة-المشبك لتوصيف خصائص النشاط الحيوي القائم على البروتين الهلاميات المائية. هذا الأسلوب يستخدم نظام (PID) نسبي-متكاملة-مشتقات تناظرية إلى تطبيق بروتوكولات القوة التي تسيطر على عينات أسطوانية المائية المستندة إلى البروتين، التي هي المربوطة بين السيارات لفائف صوت خطي ومحول قوة. خلال العملية، يضبط النظام PID تمديد العينة المائية لمتابعة بروتوكول قوة المعرفة مسبقاً بتقليل الفرق بين قوي محسوبة وتعيين نقطة. هذا النهج الفريد القائم على البروتين الهلاميات المائية يتيح الربط العينات المائية الحجم المنخفض جداً (< 5 ميليلتر) بتركيزات مختلفة من البروتين. تحت بروتوكولات منحنى القوة، حيث أن الإجهاد تطبق الزيادة والنقصان خطيا مع مرور الوقت، تمكن النظام الدراسة من مرونة والتباطؤ السلوكيات المرتبطة بالطي (الأمم المتحدة) من البروتينات، وقياس مرونة القياسية و معلمات لزج مطاطي. إطار ثابت-القوة، حيث نبض القوة قد شكل خطوة تشبه، الاستجابة المرنة، ويرجع إلى التغير في القوة، هو decoupled من الاستجابة لزج مطاطي، الذي يأتي من المجال البروتين تتكشف وريفولدينج. نظراً لانخفاض حجم العينة وبراعة في تطبيق مختلف الاضطرابات الميكانيكية، رهيوميتري القوة-المشبك هو الأمثل للتحقيق في الاستجابة الميكانيكية من البروتينات تحت القوة باستخدام نهج مجمع.
Introduction
وبصرف النظر عن وجود الخصائص الفيزيائية الفريدة، القائم على البروتين الهلاميات المائية تبشر ثورة قوة التحليل الطيفي بتمكين قياس العديد من الجزيئات مليار في أحد ‘سحب’، مما مكن دراسة البروتينات في البيئات المزدحمة، مماثلة لتلك التي ووجهت في الجلد والأنسجة الأخرى. نطاقات البروتين تظل مطوية داخل الهلاميات المائية، مما يتيح دراسة استجابتها النشاط الحيوي للقوة، والشركاء، والكيميائية الشروط الملزمة. بالإضافة إلى ذلك، يشبه الاستجابة النشاط الحيوي للبروتين المجالات داخل الهلاميات المائية استجابة ينظر مع تقنيات التحليل الطيفي قوة جزيء واحد. على سبيل المثال، ديناتورانتس الكيميائية والعوامل المؤكسدة نقصان استقرار الدولة مطوية، سواء في البروتين وحيد المجال المستوى1،،من23 والعيانية المستوى4،5 , 6 , 7-وبالمثل، أوسموليتيس زيادة استقرار البروتينات وحيدة8،9، مما يؤدي إلى انخفاض في استجابة لزج مطاطي الهلاميات المائية، لنفس قوة الظروف7،10.
ونفذت عدة نهج توليف القائم على البروتين الهلاميات المائية، أما عن طريق استخدام التفاعلات الفيزيائية11،12 أو التساهمية العابرة للربط4،13. التساهمية ردود فعل السماح لمواقع ثابتة العابرة للربط ويمكن استرداد هذه الهلاميات المائية الحالة الأولية عند إزالة الاضطرابات الميكانيكية أو الكيميائية. وتعتمد نهجاً ناجحاً العابرة للربط التساهمي على تشكيل روابط الكربون-كربون التساهمية بين الأحماض الأمينية تيروزين المكشوفة باستخدام فوق كبريتات الأمونيوم (الجزائرية) كعنصر مؤكسد وملح الروثينيوم (II) كبادئ (الشكل 1)14. عند التعرض للضوء الأبيض، حلاً بروتينات المركزة يمكن تحويله المائية. عن طريق التحكم عندما يمكن حقنها يبدأ رد الفعل، مزيج البروتين-وكالة الأنباء الجزائرية في أي شكل من أشكال صب، مثل تترافلوروايثيلين (بفتي) أنابيب (الشكل 1 باء و جيم 1)، يسمح باستخدام حجم صغير للغاية حل15. وعلاوة على ذلك، استخدام الضوء الأبيض لإحداث رد فعل cross-linking يؤدي إلى ابيضاض محدودة من البروتينات الفلورية، ويسمح بوضع مركب الهلاميات المائية مع علامات نيون (الشكل 1). استخدام أساليب تشكيل القائم على البروتين المائية الأخرى العابرة للربط على أساس والغارديان سبيتاج التفاعل التساهمية16، أمين العابرة للربط عن طريق glutaraldehyde13، أو البيوتين-streptavidin التفاعلات17.
تحليل الميكانيكية الحيوية (DMA) حاليا تقنية تستخدم على نطاق واسع لدراسة الهلاميات المائية المستندة إلى البوليمر13،18. بينما DMA يمكن تطبيق بروتوكولات النفاذ المستمر إلى الحيوية، فإنه يتطلب بواقي للشباب أكثر من 10 من الجيش الشعبي الكوري، وحجم عينة كبيرة من أكثر من 200 ميليلتر19. بسبب هذه القيود، الهلاميات المائية البروتين عادة ما تكون لينة جداً التحقيق في هذا الأسلوب. كما بوليبروتينس المهندسة يصعب توليفها من البوليمرات، نظراً لأنها تتطلب نظام معيشة لإنتاج، مثل كميات كبيرة غير فعالة، في أفضل4،15. وعلاوة على ذلك، معظم الأنسجة البيولوجية أكثر ليونة من 10 كيلو باسكال. ووضعت عدة نهج للعينات البيولوجية، لا سيما في دراسة العضلات مرونة20،21. هذه التقنيات يمكن أن تعمل أيضا تحت التغذية المرتدة لتطبيق القوة ثابتة بل هي الأمثل للعينات مع أقطار صغيرة (في نطاق ميكرون) يتعرض لقوة لأوقات قصيرة جداً (عادة أقل من 1 ثانية).
ودرست الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين بنجاح مع تقنيات رهيوميتري المعدلة. على سبيل المثال، صب في المائية في شكل الدائري يسمح باستخدام رهيوميتري اكستينسيونال لقياس التغير في القوة ذوي الخبرة كدالة لملحق4،22. استخدم نهج أخرى لدراسة خصائص انسيابية الهلاميات المائية على أساس البروتين رهيوميتري إجهاد القص التي تسيطر عليها. هذه التقنيات يمكن أيضا تحقيق حجم العينة منخفضا وتتسامح مع المواد اللينة. بيد أن هذه الأساليب عدم القدرة على تقليد سحب القوات هذا السبب البروتين التي تتكشف في فيفوويحسب معامل يونغ استناداً إلى النظريات المعقدة التي تتطلب مختلف الافتراضات والتصويبات23.
ونحن قد أبلغت مؤخرا بنهج جديد يستخدم كمية صغيرة من البروتينات، بلمرة داخل أنابيب ذات أقطار < 1 مم. كانت تعمل لدينا أول تنفيذ هذا الأسلوب في وضع المشبك الطول، حيث تم تمديد الجل بعد البروتوكول المطلوب15. في هذا الأسلوب، البروتينات تجربة تغيير مستمر في الإرشاد والقوة حين تتكشف المجالات، مما يجعل تفسير البيانات مرهقة. مؤخرا، وقد أبلغنا تقنية رهيوميتري المشبك قوة جديدة، حيث يمكن أن يعرض حلقة مفرغة الهلاميات المائية البروتين منخفضة الحجم إلى قوة المعرفة مسبقاً بروتوكول7 (الشكل 2). نظام PID تناظرية يقارن القوة تقاس باستشعار القوة مع تعيين نقطة المرسلة من الكمبيوتر ويضبط الملحق هلام بتحريك الملف الصوتي لتقليل الفرق بين اثنين من المدخلات. هذا ‘لقط’ القوة يسمح الآن لأنواع جديدة من تجارب لقياس الميكانيكا الحيوية من البروتين الهلاميات المائية.
في وضع قوة المنحدر، والتجارب المائية بروتين المربوطة الزيادة المستمرة، وانخفاض القوة مع مرور الوقت. معرف المنتج يعوض عن أي تشوه لزج مطاطي بتغيير الملحق بطريقة غير خطية، اعتماداً على النوع من البروتين والمائية صياغة. والميزة الرئيسية لمنحنى القوة أنه يسمح للتحديد الكمي لمعلمات قياسية، مثل معامل يونغ وتبديد الطاقة، نظراً تتكشف وريفولدينج نطاقات البروتين.
في وضع ثابت-القوة، التغييرات تطبق القوة بطريقة شبيهة بالخطوة. في هذا الوضع، يمتد الجل وعقود الاستيكالي عندما تزيد القوة أو انخفضت، على التوالي، تليها تشوه تعتمد على الوقت. هذا التشوه لزج مطاطي، تجري بينما الجل تجارب قوة ثابتة، ارتباطاً مباشرا بالمجال تتكشف/ريفولدينج. بطريقة مبسطة، يمكن اعتبار هذا التمديد ما يعادل عدة آثار مليار جزيء واحد متوسط معا وقياسها في كل مرة. يمكن استخدام بروتوكولات ثابت-القوة لدراسة زحف والاسترخاء من البروتين الهلاميات المائية كدالة للزمن وقوة. كدالة للقوة، لجيش صرب البوسنة على أساس البروتين الهلاميات المائية، وقد أظهرنا مؤخرا أن هناك تبعية خطي بين التمديد مطاطا ولزج مطاطي والارتداد مع سلالة التطبيقية7.
هنا نحن بالتفصيل عملية رهيوميتير القوة-المشبك استخدام المواد الهلامية المركبة المصنوعة من خليط بروتين L (المجالات 824، وصفت ل8) وبنية بروتين L-اجفب (L-اجفب)، مما يجعل المائية الإجمالية الفلورسنت وسهلة إظهار.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يمكننا وصف تقنية المشبك قوة رهيوميتري للتحقيق في رد النشاط الحيوي صغيرة الحجم على أساس البروتين الهلاميات المائية. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفيرها على بروتوكول لتجميع عينة المائية موحدة بروتين منخفضة الحجم أسطواني. بروتوكول يرد أيضا الذي يصف كيفية ربط أنواع مختلفة من الهلاميات المائ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف بالدعم المالي من “البحوث مبادرة النمو” (جائزة رقم 101 X 340)، المؤسسة الوطنية للعلوم، برنامج الأجهزة البحثية الرئيسية (رقم المنحة PHY-1626450)، أكبر مؤسسة ميلووكي (جائزة شو) ونظام جامعة ويسكونسن (منح البحوث التطبيقية).
Materials
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips – 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
References
- Cao, Y., Li, H. How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins?. Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).
- Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
- Wiita, A. P., et al. Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force. Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Plumere, N., et al. A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage. Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).
- Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties. Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).
- Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry. Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).
- Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains. Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).
- Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy. Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).
- Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes. Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).
- Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).
- Sathaye, S., et al. Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface?. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).
- Ma, X., et al. A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling. Scientific Reports. 6, 19370 (2016).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).
- Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).
- Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).
- Thompson, M. S., et al. Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture. Chimie. 21 (8), 3178-3182 (2015).
- Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load. Biomedical Materials. 12 (2), (2017).
- Desai, M. S., et al. Elastin-Based Rubber-Like Hydrogels. Biomacromolecules. 17 (7), 2409-2416 (2016).
- Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle. Nature Communications. 7, (2016).
- McDonald, K. S. Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres. Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).
- Wu, J. H., et al. Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties. Nature Communications. 9, (2018).
- Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear. Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).
- Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).
- Valle-Orero, J., et al. Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing. Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).
- Fang, J., et al. Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels. Nature Communications. 4, (2013).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. Bioinks for 3D bioprinting: an overview. Biomaterial Science. , (2018).
