Force-klemme Rheometry for å karakterisere Protein-basert Hydrogels

Summary

En ny kraft-klemme rheometry teknikk brukes til å undersøke de mekaniske egenskapene av lavt volum protein-basert hydrogel prøver bundet mellom en talespole motor og en kraft-sensor. En analog proporsjonal-integrert-derivat (PID) systemet tillater ‘klemmekraften”av force erfarne til ønsket protokollen.

Abstract

Her beskriver vi en kraft-klemme rheometry metode for å beskrive egenskapene biomekaniske protein-basert hydrogels. Denne metoden bruker et analogt proporsjonal-integrert-derivat (PID) system bruke kontrollert-force protokoller på sylindriske protein-basert hydrogel prøver, som er bundet mellom en lineær talespole motor og en force svinger. Under drift justerer PID systemet forlengelse av hydrogel prøven å følge en forhåndsdefinert kraft-protokollen ved å minimere forskjellen mellom den målte og set-punktet styrker. Denne unike tilnærming til protein-basert hydrogels gir deling av ekstremt lavt volum hydrogel prøver (< 5 µL) med annet protein konsentrasjoner. Under kraft-rampen protokoller, der anvendt stress øker og reduseres lineært med tid, systemet muliggjør studiet av elastisitet og hysteresis atferd tilknyttet (FN) folding av proteiner og måling av standard elastisk og viskoelastiske parametere. Under konstant-force, der kraft pulsen har en trinn-lignende figur, elastisk svaret, grunn til endringen i kraft, er avparet fra viskoelastiske svaret, som kommer fra protein domene Utfolding og refolding. P.g.a. lav-volum utvalg og allsidighet i å søke ulike mekaniske forstyrrelser, er kraft-klemme rheometry optimalisert for å undersøke mekanisk respons på proteiner under kraft med en bulk tilnærming.

Introduction

Tillegg unike fysiske egenskaper, holder protein-basert hydrogels løftet om revolusjonerende kraft spektroskopi ved å aktivere måling av flere milliarder molekyler i en “pull”, dermed muliggjør studiet av proteiner i overfylte miljøer lik de i hud og andre vev. Protein domener forblir foldet i hydrogels, slik at studiet av deres biomekaniske Svar å tvinge, bindende partnere og kjemiske forhold. I tillegg ligner biomekaniske responsen av protein domener i hydrogels svaret sett med single-molekylet force spektroskopi teknikker. For eksempel redusere kjemiske denaturants og Oksiderende stoffer stabiliteten på brettet staten, både på enkelt protein domenet nivå^1,2,3 og på makroskopisk nivå^{4,5 , 6 , 7}. tilsvarende osmolytes øke stabiliteten av enkelt proteiner^8,9, fører til en reduksjon i viskoelastiske svaret av hydrogels, for det samme tvinge forhold^7,10.

Flere tilnærminger har blitt implementert for å syntetisere protein-basert hydrogels, enten ved hjelp av fysisk interaksjon^11,12 eller kovalente cross-linking^4,13. Kovalente reaksjoner tillater faste cross-linking steder og disse hydrogels kan gjenopprette den opprinnelige tilstanden på en fjerning av mekanisk eller kjemikalie forstyrrelser. En vellykket tilnærming for kovalente cross-linking er avhengig av danner kovalente karbon-karbon obligasjoner mellom synlige tyrosin aminosyrer med ammonium persulfate (APS) som en oksiderende og en ruthenium (II) salt som en initiativtaker (figur 1)¹⁴. Ved eksponering til hvitt lys, kan en løsning av konsentrert proteiner bli forvandlet til en hydrogel. Ved å kontrollere når den reaksjon starter, protein-APS blandingen kan injiseres i støping skjemaer, tillater som polytetrafluoroethylene (PFTE) rør (figur 1B og 1 C), bruk av en ekstremt liten løsning volum¹⁵. Videre bruk av hvitt lys utløse cross-linking reaksjon resulterer i en begrenset bleking fluorescerende proteiner og lar utformingen av sammensatte hydrogels med fluorescerende indikatorer (figur 1). Andre protein-basert hydrogel formasjon metoder bruke cross-linking basert på SpyTag-SpyCatcher kovalente samhandling¹⁶, Amin cross-linking via glutaraldehyde¹³eller biotin-streptavidin vekselsvirkningene¹⁷.

Dynamisk mekanisk analyse (DMA) er en teknikk som er mye brukt til å studere polymer-baserte hydrogels^13,18. Mens DMA kan gjelde konstant force protokoller for biologisk materiale, krever det Youngs moduli over 10 kPa og stort utvalg volum mer enn 200 µL¹⁹. På grunn av disse begrensningene er protein hydrogels for myk undersøkes av denne teknikken. Som utviklet polyproteins er vanskeligere å syntetisere enn polymerer, siden de krever en levende system å produsere, er slike høyt volum ineffektivt, beste^4,15. Videre er de fleste biologiske vev mykere enn 10 kPa. Flere tilnærminger ble utviklet for biologiske prøver, spesielt i studiet av muskel elastisitet^20,21. Disse teknikkene kan også operere under tilbakemelding til bruk konstant kraft men er optimalisert for prøver med liten diameter (i området mikron) utsatt for å tvinge for svært kort tid (vanligvis mindre enn 1 s).

Protein-basert hydrogels ble vellykket studert med endrede rheometry teknikker. For eksempel tillater støping av hydrogel i ringen form bruk av extensional rheometry å måle endringen i den erfarne kraften som en funksjon av filtypen^4,22. Andre tilnærminger for å studere reologiske egenskapene til protein-basert hydrogels bruke kontrollert skjær-stress rheometry. Disse teknikkene kan oppnå lav eksempel volum og tolerere myke materialer. Men disse metodene manglende evne til å etterligne trekke styrker som årsak protein utspiller seg i vivo, og Youngs modul beregnes basert på komplekse teorier som krever ulike forutsetninger og korrigeringer²³.

Vi har nylig rapportert en ny tilnærming som bruker en liten mengde proteiner, polymerized inni rør med diameter < 1 mm. Første implementeringen av denne teknikken var opererer i lengde-klemme modus, hvor gel ble utvidet etter ønsket protokollen¹⁵. I denne metoden oppleve proteiner en kontinuerlig endring i både utvidelse og styrke mens domenene utfolder seg, gjør data tolkningen tungvint. Vi har nylig rapportert en ny kraft-klemme rheometry teknikk, hvor en feedback loop kan utsette lavt volum protein hydrogels til en forhåndsdefinert force protokollen⁷ (figur 2). En analog PID systemet sammenligner styrken målt ved kraft-sensor med settpunkt sendes fra datamaskinen og justerer gel filtypen ved å flytte talespole å redusere forskjellen mellom de to inngangene. Denne ‘clamping’ av force nå innrømmer for nye typer eksperimenter å måle biomekanikk av protein hydrogels.

I kraft-rampen modus opplever en bundet protein hydrogel en konstant økning og reduksjon av makt med tid. PID kompenserer for alle viskoelastiske deformasjon ved å endre filtypen i en ikke-lineær måte, avhengig av protein og hydrogel formulering. Den største fordelen med kraften rampen er at det tillater kvantifiseringen standard parametere som Youngs modul og energi ødsling, en utfoldelse og refolding av protein domener.

I konstant-force-modus, brukes kraft endringer i en trinn-aktig måte. I denne modusen gel utvides og kontrakter elastisk når kraften økes eller reduseres, henholdsvis, etterfulgt av en tidsavhengige deformasjon. Denne viskoelastiske deformasjon, finner sted mens gel opplever en konstant styrke, er direkte relatert til domenet unfolding/refolding. I en forenklet måte, kan denne utvidelsen sees som tilsvarer flere milliarder ett molekyl spor gjennomsnitt sammen og målt på en gang. Konstant-force protokoller kan brukes til å studere krype og avslapning av protein hydrogels som en funksjon og tid. Som en funksjon av force for BSA-basert protein hydrogels, har vi nylig vist at det er en lineær avhengighet mellom elastisk og viskoelastiske og rekyl med anvendt belastning⁷.

Her detalj vi bruk av et force-klemme rheometer bruker sammensatte gels laget av en blanding av protein L (8 domener²⁴, som L₈) og en protein L-eGFP konstruksjon (L-eGFP), som gjør det totale hydrogel fluorescerende og lett å vise.

Protocol

1. reagenser løsning forberedelse Forberede en start protein løsning oppløsning/fortynne protein av interesse for den ønskede konsentrasjonen, bruker en Tris buffer [20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane og 150 mM NaCl, pH 7.4].Merk: Den minste protein konsentrasjonen for hvilke cross-linking fører til hydrogels avhenger av protein brukes og er vanligvis > 1 mM. Forberede bestander av ammonium persulfate (APS) (1 M) og tris(bipyridine)ruthenium(II) fra ([Ru(bpy)3]2 +) …

Representative Results

Figur 1A viser ordningen med fotoaktive reaksjonen brukes å syntetisere L-EGP/L8 hydrogel. Figur 1B viser hydrogel blandingen i PTFE tube før og etter photoactivation. Figur 1 c presenterer ekstrudert L-eGFP-L8 hydrogel inne en Tris løsning. Hydrogel utvalget har ingen strukturelle feil som hakk. Hydrogels med synlig skade bør forkastes. <p class="jove_content" fo:keep-t…

Discussion

Her beskriver vi en kraft-klemme rheometry teknikk for å undersøke biomekaniske respons på lavt volum protein-basert hydrogels. I tillegg tilbys en protokoll for å syntetisere et ensartet sylindriske lavt volum protein hydrogel utvalg. En protokoll er også presentert som beskriver hvordan å knytte ulike typer protein-basert hydrogels med ulike elastisiteter uten å forårsake noe mekanisk deformasjon eller skade til protein-basert hydrogel prøver eller forsinkelse av gel på krokene. Analoge PID systemet, sammen m…

Materials

SI-KG4A force transducer	World Precision Instruments (WPI)	SI-KG4A
Linear Voice Coil Motor	Equipement Solutions	LFA2010
Bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals (RMBIO)	BSA-AAF-1XG / 100 G
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503-1KG
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	248614-100G
Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride	Sigma-Aldrich	544981-1G
EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK	Fisher Scientific	NC0395626
1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip	BD	309628
Silane, Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll	Cole-Parmer	EW-06417-21
Hypodermic Needle, 23 Gauge	Healthcare Supply Pros	305194
Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips – 24 gauge	KIMCO	JG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp	ALB	USH-103D USHIO
Medical Tweezers
Medical scissors
Olympus
The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author.