Modifiera baculoviridae uttryck vektorer att producera utsöndras växtproteiner i insekt celler
Summary
Här presenterar vi protokoll för att utnyttja insekt cell baculoviridae protein uttryck systemet och för att producera stora mängder utsöndras växtproteiner för protein kristallisering. En baculoviridae uttryck vektor har modifierats med antingen GP67 eller insekt hemolin signal peptiden för växt proteinuttryck sekretion i insekt celler.
Abstract
Det har varit en utmaning för forskarna att uttrycka rekombinant sekretoriska eukaryota proteiner för strukturella och biokemiska studier. Systemets baculoviridae-medierad insekt cell uttryck är ett av de system som används för att uttrycka rekombinant eukaryota sekretoriska proteiner med vissa post-translationella modifieringar. De sekretoriska proteinerna behöver att dirigeras via den sekretoriska vägar för protein glycosylation, disulfide obligationer bildandet och andra post-translationella modifieringar. För att förbättra det befintliga insekt cell uttrycket av sekretoriska växtproteiner, ändras en baculoviridae uttryck vektor genom tillägg av antingen en GP67 eller en hemolin signal peptid sekvens mellan arrangören och multipel-kloning platser. Detta nydesignade modifierade vector systemet produceras framgångsrikt en hög avkastning av löslig rekombinant utsöndrade receptor växtproteiner av Arabidopsis thaliana. Två av de uttryckta växtproteiner, de extracellulära domänerna av Arabidopsis TDR och PRK3 plasma membranreceptorer, var kristalliserad för röntgen kristallografiska studier. Modifierade vector systemet är ett bättre verktyg som kan potentiellt användas för uttrycket av rekombinant sekretoriska proteiner i djurriket samt.
Introduction
Det är absolut nödvändigt för ett forskningslaboratorium vara kapabel att producera stora mängder homogen rekombinanta proteiner för biokemiska och biofysiska karakteriseringar, särskilt för röntgen kristallografiska studier. Det finns många väletablerade heterologa uttryck system till exempel Escherichia coli, jäst, insekt celler, däggdjursceller, växtceller, etc. bland dem, systemets baculoviridae-medierad insekt cell uttryck är en av mest vanligt förekommande tekniker för att producera stora mängder strukturellt vikta stora rekombinanta eukaryota proteiner för protein kristallisering1.
Uttryck vektorerna av baculoviridae uttryck systemet är konstruerade för att innehålla en stark polyhedrin eller P10 arrangören att producera en hög avkastning av rekombinant intracellulära proteiner2,3. För att göra en rekombinant baculoviridae, klonas genen av intresse i en insekt vektor som innehåller det polyhedrin (polh) locus av Autographa californica multi-nucleopolyhedroviral genomet. Den resulterande konstruktionen sedan sekvenseras och dess rätta öppen läsning ram (ORF) är verifierade. Den rätta bygga sedan införs i insekt värdcellen genom processen att transfection. Gen av intresse infogas i det virala genomet av homolog rekombination. Denna händelse resulterar i produktion av rekombinant virala arvsmassan, som sedan replikerar att producera rekombinant ympade virus partiklar1.
Insekt celler som oftast används i uttryck systemet är Sf9 och hög fem (Hi5) celler. Sf9 celler är en klonal isolatet av Sf21, härrör från Spodoptera frugiperda, Pupp äggstockscancer celler och Hi5 celler är en klonal isolatet härrör från föräldrarnas Trichoplusia ni cystor cell linje TN-3684,5. Samtidig transfections, virus förstärkning och plack analyser genomförs Sf9 celler, medan Hi5 celler väljs vanligtvis att producera större mängder av rekombinanta proteiner6. Det är värt att notera att Hi5 cellerna inte är lämpliga för generering och förstärkning av virus avkommor på grund av deras tendens att producera muterade virus. Traditionellt, anses en temperatur mellan 25-30 ° C vara bra för odling av insekt celler. Det har dock rapporterats att 27-28 ° C är den optimala temperaturen för insekt cell tillväxt och infektion7,8.
Införandet av en stark signal sekvens före genen behövs av hög uttryck för utsöndras proteinerna. Sekvensen signal skulle effektivt vägleda det översatta rekombinant proteinet i endoplasmatiska retiklet för protein sekretion och post-translationella modifieringar behövs för korrekt vikning och stabilisering3. Signalen peptid sekvenser, har såsom baculoviridae omsluta protein GP64/67, honungsbinas melittin och andra, valt att underlätta uttrycket av sekretoriska rekombinanta proteiner i baculoviridae-medierade uttryck system3. Införandet av signal peptiden av GP67 har visat sig förbättra uttryck avkastningen av ett utsöndrade rekombinant protein, i jämförelse med med den inneboende signal peptiden av mål genen9. Hemolin är ett hemolymph protein av giant silk moth Hyalophora Kekropia, inducerad på bakterier infektion10. På grund av den relativt höga inducerad uttryck, kan signal peptid sekvensen av genen användas att medla sekretion uttrycket av rekombinanta proteiner i den baculoviridae-insektscellsystemet.
I A. thaliana Tracheary Element differentiering hämmande faktor Receptor (TDR) och Pollen Receptor tyrosinkinashämmare 3 (PRK3) båda hör till växtfamiljen leucin-rika upprepa Receptor-liknande Kinase (LRR-RLK) av proteiner11,12 . För att studera struktur och funktion av denna familj av receptorn växtproteiner, samt att underlätta de strukturella och biokemisk karakteriseringen av andra utsöndras växtproteiner, har den baculoviridae insektscellsystemet-uttryck ändrats till förbättra protein kvalitet och produktion avkastning. De extracellulära domänerna av både TDR och PRK3 har framgångsrikt uttryckts med två modifierade uttryck vektorer i den baculoviridae insektscellsystemet-uttryck. Båda de extracellulära domänerna av TDR och PRK3 proteiner har varit kristalliseras. Denna artikel rapporterar uttryck och rening av stora mängder rekombinant utsöndrade växtproteiner med två modifierade baculoviridae uttryck vektorer genom att införliva antingen en GP67 eller en hemolin signal sekvens mellan arrangören och flera kloning platser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beroende på skillnaderna i storlek och stabilitet av tusentals proteiner närvarande i de biologiska systemen, är det ofta empiriska för en forskning laboratorium för att bestämma vilket heterologa uttryck system har väljas för uttrycket av ett specifikt protein. Systemets E. coli uttryck är ofta det första valet för proteinuttryck på grund av den korta livslängd av bakterier, låg kostnad av kultur media och relativt lätt att skala upp19. För uttrycket av stora eukaryota pr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av de nya fakultetsmedel start från North Carolina State University för Guozhou Xu.
Materials
| Incubator shaker | VWR | Model Excella E25 | 27 oC |
| Incubator | VWR | Model 2005 | 27 oC |
| Centrifuge | BECKMAN | Model J-6 | with a swing bucket rotor |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent | 600677-51 | For PCR amplification of DNA |
| Thermal Cycler | BIO-RAD | Model C1000 Touch | For PCR amplification of DNA |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Model I 24 | For growing baceria culture |
| Customer DNA synthesis | GENSCRIPT | ||
| BamHI (HF) | New England Biolabs | R3136S | Restriction Endonuclease |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | Restriction Endonuclease |
| NotI (HF) | New England Biolabs | R3189S | Restriction Endonuclease |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Restriction Endonuclease |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | DNA ligation |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | DNA purification from Agorase gel |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid DNA purification from bacteria culture |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 15510-019 | For DNA gel electropherosis |
| MAX Efficiency DH5α competen cell | Invitrogen | 18-258-012 | For transformation of DNA ligation mixture |
| Lennox L LB Broth | Research Product International Corp. | L24066-5000.0 | For making bacteria culture |
| Ampicillin sodium salt | Thermo Fisher Scientific | 11593-019 | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 15160-054 | Antibiotics |
| Tetracycline | Thermo Fisher Scientific | 64-75-5 | Antibiotics |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710-064 | Antibiotics |
| MAX Efficiency DH10Bac competent cells | Thermo Fisher Scientific | 10361-012 | For making bacmid DNA |
| S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544-034 | For DNA transformation |
| CellFECTIN II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362-101 | Insect cell transfection reagent |
| Bac-to-Bac Expression System | Thermo Fisher Scientific | 10359-016 | Baculovirus-insect cells expression kit |
| Bluo-gal | Thermo Fisher Scientific | 15519-028 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 15529-019 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| pFastBac1 | Thermo Fisher Scientific | 10360014 | Baculorirus expression vector |
| Sf9 cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 monolayer cells |
| Hi5 cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | High Five insect cells |
| Grace’s insect medium, unsupplemented | Thermo Fisher Scientific | 11595030 | Sf9 cell transfection minimum medium |
| Grace’s insect medium, supplemented | Thermo Fisher Scientific | 11605102 | Sf9 monolayer cell culture complete medium |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher Scientific | 10902104 | Sf9 suspension cell culture medium without FBS |
| Express Five SFM | Thermo Fisher Scientific | 10486025 | Hi5 cell culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 ml (10,000 I.U./ml) |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | 100 ml |
| FBS Certified | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | 500 ml |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 08-772-1B | Flat-bottom |
| 150 mm plates | Thermo Fisher Scientific | 353025 | 100/case |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 500 tubes/bag |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1475-0511 | 25 tubes/bag |
| 50 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1500-1211 | 25 tubes/bag |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | NiNTA resin |
| pH-indicator strips | EMD Millipore Corporation | 1.09535.0001 | pH 0 – 14 |
References
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnology Progress. 30, 1-18 (2014).
- Khan, S., Ng, M. L., Tan, Y. J. Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the assembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expression system. Methods in Molecular Biology. 379, 35-50 (2007).
- Possee, R. D., King, L. A. Baculovirus Transfer Vectors. Methods in Molecular Biology. 1350, 51-71 (2016).
- Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., McCawley, P. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro. 13, 213-217 (1977).
- Hink, W. F. Established insect cell line from the cabbage looper, Trichoplusia ni. Nature. 226, 466-467 (1970).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cellular & Development Biology – Animal. 29A, 388-390 (1993).
- Wickham, T. J., Nemerow, G. R. Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system. Biotechnology Progress. 9, 25-30 (1993).
- Davis, T. R., Trotter, K. M., Granados, R. R., Wood, H. A. Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion. Nature Biotechnology. 10, 1148-1150 (1992).
- Murphy, C. I., et al. Enhanced expression, secretion, and large-scale purification of recombinant HIV-1 gp120 in insect cell using the baculovirus egt and p67 signal peptides. Protein Expression and Purification. 4, 349-357 (1993).
- Sun, S. C., Lindstrom, I., Boman, H. G., Faye, I., Schmidt, O. Hemolin: an insect-immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily. Science. 250, 1729-1732 (1990).
- Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. Differential CLE peptide perception by plant receptors implicated from structural and functional analyses of TDIF-TDR interactions. PLoS One. 12, e0175317 (2017).
- Chakraborty, S., Pan, H., Tang, Q., Woolard, C., Xu, G. The Extracellular Domain of Pollen Receptor Kinase 3 is structurally similar to the SERK family of co-receptors. Scientific Reports. 8, 2796 (2018).
- Khorana, H. G. Total synthesis of a gene. Science. 203, 614-625 (1979).
- Bahl, C. P., Marians, K. J., Wu, R. A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles. Gene. 1, 81-92 (1976).
- Xu, W., Zhang, Y. Isolation and Characterization of Vaccine-Derived Polioviruses, Relevance for the Global Polio Eradication Initiative. Methods in Molecular Biology. 1387, 213-226 (2016).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, 557-580 (1983).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Reddy, B. G., et al. Expression and purification of the alpha subunit of the epithelial sodium channel, ENaC. Protein Expression and Purification. 117, 67-75 (2016).
- Harris, T. J., Emtage, J. S. Expression of heterologous genes in E. coli. Microbiological Sciences. 3, 28-31 (1986).
- Kaur, J., Kumar, A., Kaur, J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements. International Journal of BIological Macromolecules. 106, 803-822 (2018).
- Guo, Y., Yang, F., Tang, X. An Overview of Protein Secretion in Yeast and Animal Cells. Methods in Molecular Biology. 1662, 1-17 (2017).
- Blight, M. A., Chervaux, C., Holland, I. B. Protein secretion pathway in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 5, 468-474 (1994).
- Idiris, A., Tohda, H., Kumagai, H., Takegawa, K. Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 403-417 (2010).
- Wormald, M. R., Dwek, R. A. Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability. Structure. 7, R155-R160 (1999).
- Geisler, C., Mabashi-Asazuma, H., Jarvis, D. L. An Overview and History of Glyco-Engineering in Insect Expression Systems. Methods in Molecular Biology. 1321, 131-152 (2015).
- Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa. Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).
- Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).
- Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells. Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).
- Dohi, K., et al. Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells. Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).
