Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos
Summary
Aquí, presentamos los protocolos para la utilización de la célula y baculovirus proteína expresión sistema insecto para producir grandes cantidades de proteínas vegetales segregada para la cristalización de proteínas. Un vector de expresión de baculovirus se ha modificado con GP67 o insectos hemolin péptido señal para la expresión de la secreción de la proteína de planta en células de los insectos.
Abstract
Ha sido un reto para los científicos expresar proteínas recombinantes de eucariotas secretores para estudios estructurales y bioquímicos. El sistema de expresión celular de insecto baculovirus-mediada es uno de los sistemas utilizados para expresar proteínas secretoras eucarióticas recombinantes con algunas modificaciones poste-de translación. Las proteínas secretoras que deba canalizarse a través de las vías secretoras de glycosylation de la proteína, formación de enlaces disulfuro y otras modificaciones poste-de translación. Para mejorar la expresión de células de insectos existentes de proteínas secretoras de vegetales, un vector de expresión de baculovirus se modifica por la adición de un GP67 o una secuencia de péptido señal hemolin entre el promotor y la clonación de múltiples sitios. Este sistema de nuevo diseño vector modificado había producido con éxito un alto rendimiento de proteínas de receptor soluble recombinante planta secretada de Arabidopsis thaliana. Dos de las proteínas de la planta expresada, los dominios extracelulares de los receptores de membrana plasmática de Arabidopsis TDR y PRK3, se cristalizaron para estudios cristalográficos de rayos x. El sistema vector modificado es una herramienta mejorada que potencialmente puede ser utilizada para la expresión de proteínas recombinantes secretores en el reino animal también.
Introduction
Es imprescindible para un laboratorio de investigación ser capaces de producir grandes cantidades de proteínas recombinantes homogéneas para caracterizaciones bioquímicas y biofísicas, especialmente para estudios cristalográficos de rayos x. Existen muchos sistemas de expresión heteróloga bien establecido como Escherichia coli, levaduras, células de los insectos, células de mamíferos, células de la planta, etc. entre ellos, el sistema de expresión celular de insecto baculovirus-mediada es uno de los más usan técnicas para producir grandes cantidades de proteínas eucarióticas recombinantes gran tamaño estructural plegadas para la cristalización de proteínas1.
Los vectores de expresión del sistema de expresión de baculovirus se han diseñado para contener una fuerte polyhedrin o promotor de P10 para producir un alto rendimiento de proteínas recombinantes intracelular2,3. Para hacer un baculovirus recombinante, se clona el gen de interés en un insecto vector que contiene el locus polyhedrin (polh) del genoma de nucleopolyhedroviral múltiple de Autographa californica . La construcción resultante luego se ordena y se verifica su marco correcto de lectura abierta (ORF). La construcción correcta es entonces introducida en la célula de insecto huésped a través del proceso de transfección. El gen de interés se inserta en el genoma viral por recombinación homóloga. Este evento resulta en la producción del genoma viral recombinante, que luego se replica en producir recombinantes reverdeció de partículas de virus1.
Las células de los insectos que comúnmente se utilizan en el sistema de expresión son Sf9 y cinco celdas (Hi5). Las células SF9 son un aislamiento clonal de Sf21, derivado de las células ováricas pupas de Spodoptera frugiperda, y células de Hi5 un aislamiento clonal derivado de la parental Trichoplusia ni ovárico de la célula línea TN-3684,5. Transfecciones Co, amplificación virus y ensayos de placa se llevan a cabo en las células Sf9, mientras que las células Hi5 típicamente se seleccionan para producir mayores cantidades de proteínas recombinantes6. Cabe destacar que las células de Hi5 no son adecuadas para la generación y amplificación de progenie del virus debido a su tendencia a producir virus mutantes. Tradicionalmente, un rango de temperatura de 25-30 ° C se considera buena para el cultivo de células de los insectos. Sin embargo, se ha reportado que 27-28 ° C es la temperatura óptima para el insecto célula crecimiento e infección7,8.
La introducción de una secuencia de señal fuerte precede el gene es necesario para la alta expresión de las proteínas secretadas. La secuencia de la señal guía eficientemente la proteína recombinante traducida en el retículo endoplásmico para la secreción de proteínas y modificaciones postraduccionales necesarias para el plegamiento correcto y estabilización3. Secuencias de péptidos de señal, tales como el baculovirus envuelven proteína GP64/67, abeja melitina y otros, han sido elegidas para facilitar la expresión de proteínas recombinantes secretores en los sistemas de expresión de baculovirus-mediada3. La introducción del péptido señal de GP67 ha demostrado para mejorar el rendimiento de la expresión de una proteína recombinante secretada, en comparación con usando el péptido señal intrínseca del objetivo gen9. Hemolin es una proteína de la hemolinfa de la polilla de seda gigante Hyalophora cecropia, inducida por bacterias infección10. Debido al relativamente alto nivel de expresión inducida, puede utilizarse la secuencia del péptido de señal del gen para mediar en la expresión de la secreción de proteínas recombinantes en el sistema de células de insecto baculovirus.
La a. thaliana Tracheary elementos diferenciación inhibidor Factor Receptor (TDR) y el polen del Receptor quinasa 3 (PRK3), ambos pertenecen a la Leucine-rich Repeat Receptor-como Kinase (LRR-RLK) familia de proteínas11,12 . Para estudiar la estructura y la función de esta familia de receptores proteínas vegetales, así como para facilitar la caracterización bioquímica y estructural de otras proteínas vegetales secretada, se ha modificado el sistema de expresión de baculovirus-insecto célula a mejorar el rendimiento de producción y calidad de proteína. Los dominios extracelulares de TDR y PRK3 se han expresado con éxito mediante dos vectores de expresión modificada en el sistema de expresión de células de insecto baculovirus. Tanto los dominios extracelulares de proteínas TDR y PRK3 han se ha cristalizado. Este artículo divulga la expresión y purificación de grandes cantidades de proteínas recombinantes secretadas planta con vectores de expresión de baculovirus modificados dos incorporando un GP67 o una secuencia de señal hemolin entre el promotor y múltiples sitios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dada la diversidad de tamaño y estabilidad de los miles de proteínas presentes en los sistemas biológicos, a menudo es empírica para la investigación de un laboratorio para decidir qué sistema de expresión heteróloga debe elegirse para la expresión de una proteína específica. El sistema de expresión de e. coli es a menudo la primera opción para la expresión de la proteína debido al corto ciclo de vida de las bacterias, bajo costos de los medios de cultivo y la relativa facilidad para escalar<sup c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los nuevos fondos de inicio de la Facultad de la Universidad Estatal de Carolina del norte para Guozhou Xu.
Materials
| Incubator shaker | VWR | Model Excella E25 | 27 oC |
| Incubator | VWR | Model 2005 | 27 oC |
| Centrifuge | BECKMAN | Model J-6 | with a swing bucket rotor |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent | 600677-51 | For PCR amplification of DNA |
| Thermal Cycler | BIO-RAD | Model C1000 Touch | For PCR amplification of DNA |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Model I 24 | For growing baceria culture |
| Customer DNA synthesis | GENSCRIPT | ||
| BamHI (HF) | New England Biolabs | R3136S | Restriction Endonuclease |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | Restriction Endonuclease |
| NotI (HF) | New England Biolabs | R3189S | Restriction Endonuclease |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Restriction Endonuclease |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | DNA ligation |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | DNA purification from Agorase gel |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid DNA purification from bacteria culture |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 15510-019 | For DNA gel electropherosis |
| MAX Efficiency DH5α competen cell | Invitrogen | 18-258-012 | For transformation of DNA ligation mixture |
| Lennox L LB Broth | Research Product International Corp. | L24066-5000.0 | For making bacteria culture |
| Ampicillin sodium salt | Thermo Fisher Scientific | 11593-019 | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 15160-054 | Antibiotics |
| Tetracycline | Thermo Fisher Scientific | 64-75-5 | Antibiotics |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710-064 | Antibiotics |
| MAX Efficiency DH10Bac competent cells | Thermo Fisher Scientific | 10361-012 | For making bacmid DNA |
| S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544-034 | For DNA transformation |
| CellFECTIN II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362-101 | Insect cell transfection reagent |
| Bac-to-Bac Expression System | Thermo Fisher Scientific | 10359-016 | Baculovirus-insect cells expression kit |
| Bluo-gal | Thermo Fisher Scientific | 15519-028 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 15529-019 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| pFastBac1 | Thermo Fisher Scientific | 10360014 | Baculorirus expression vector |
| Sf9 cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 monolayer cells |
| Hi5 cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | High Five insect cells |
| Grace’s insect medium, unsupplemented | Thermo Fisher Scientific | 11595030 | Sf9 cell transfection minimum medium |
| Grace’s insect medium, supplemented | Thermo Fisher Scientific | 11605102 | Sf9 monolayer cell culture complete medium |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher Scientific | 10902104 | Sf9 suspension cell culture medium without FBS |
| Express Five SFM | Thermo Fisher Scientific | 10486025 | Hi5 cell culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 ml (10,000 I.U./ml) |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | 100 ml |
| FBS Certified | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | 500 ml |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 08-772-1B | Flat-bottom |
| 150 mm plates | Thermo Fisher Scientific | 353025 | 100/case |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 500 tubes/bag |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1475-0511 | 25 tubes/bag |
| 50 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1500-1211 | 25 tubes/bag |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | NiNTA resin |
| pH-indicator strips | EMD Millipore Corporation | 1.09535.0001 | pH 0 – 14 |
References
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnology Progress. 30, 1-18 (2014).
- Khan, S., Ng, M. L., Tan, Y. J. Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the assembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expression system. Methods in Molecular Biology. 379, 35-50 (2007).
- Possee, R. D., King, L. A. Baculovirus Transfer Vectors. Methods in Molecular Biology. 1350, 51-71 (2016).
- Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., McCawley, P. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro. 13, 213-217 (1977).
- Hink, W. F. Established insect cell line from the cabbage looper, Trichoplusia ni. Nature. 226, 466-467 (1970).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cellular & Development Biology – Animal. 29A, 388-390 (1993).
- Wickham, T. J., Nemerow, G. R. Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system. Biotechnology Progress. 9, 25-30 (1993).
- Davis, T. R., Trotter, K. M., Granados, R. R., Wood, H. A. Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion. Nature Biotechnology. 10, 1148-1150 (1992).
- Murphy, C. I., et al. Enhanced expression, secretion, and large-scale purification of recombinant HIV-1 gp120 in insect cell using the baculovirus egt and p67 signal peptides. Protein Expression and Purification. 4, 349-357 (1993).
- Sun, S. C., Lindstrom, I., Boman, H. G., Faye, I., Schmidt, O. Hemolin: an insect-immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily. Science. 250, 1729-1732 (1990).
- Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. Differential CLE peptide perception by plant receptors implicated from structural and functional analyses of TDIF-TDR interactions. PLoS One. 12, e0175317 (2017).
- Chakraborty, S., Pan, H., Tang, Q., Woolard, C., Xu, G. The Extracellular Domain of Pollen Receptor Kinase 3 is structurally similar to the SERK family of co-receptors. Scientific Reports. 8, 2796 (2018).
- Khorana, H. G. Total synthesis of a gene. Science. 203, 614-625 (1979).
- Bahl, C. P., Marians, K. J., Wu, R. A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles. Gene. 1, 81-92 (1976).
- Xu, W., Zhang, Y. Isolation and Characterization of Vaccine-Derived Polioviruses, Relevance for the Global Polio Eradication Initiative. Methods in Molecular Biology. 1387, 213-226 (2016).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, 557-580 (1983).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Reddy, B. G., et al. Expression and purification of the alpha subunit of the epithelial sodium channel, ENaC. Protein Expression and Purification. 117, 67-75 (2016).
- Harris, T. J., Emtage, J. S. Expression of heterologous genes in E. coli. Microbiological Sciences. 3, 28-31 (1986).
- Kaur, J., Kumar, A., Kaur, J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements. International Journal of BIological Macromolecules. 106, 803-822 (2018).
- Guo, Y., Yang, F., Tang, X. An Overview of Protein Secretion in Yeast and Animal Cells. Methods in Molecular Biology. 1662, 1-17 (2017).
- Blight, M. A., Chervaux, C., Holland, I. B. Protein secretion pathway in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 5, 468-474 (1994).
- Idiris, A., Tohda, H., Kumagai, H., Takegawa, K. Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 403-417 (2010).
- Wormald, M. R., Dwek, R. A. Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability. Structure. 7, R155-R160 (1999).
- Geisler, C., Mabashi-Asazuma, H., Jarvis, D. L. An Overview and History of Glyco-Engineering in Insect Expression Systems. Methods in Molecular Biology. 1321, 131-152 (2015).
- Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa. Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).
- Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).
- Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells. Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).
- Dohi, K., et al. Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells. Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).
