Liposomi antigenici per la generazione di anticorpi specifici per la malattia
Summary
Descritto è la preparazione di nanoparticelle liposomiale antigeniche e loro uso nella stimolante della B-cellula attivazione in vitro e in vivo. Risposte anticorpali coerente e stabile ha condotto allo sviluppo di un nuovo modello di allergia dell’arachide. Il protocollo per la generazione di liposomi antigenici può essere estesa a diversi antigeni e modelli di immunizzazione.
Abstract
Risposte anticorpali forniscono immunità protettiva critico per una vasta gamma di agenti patogeni. Ci rimane un elevato interesse nel generare anticorpi robusti per la vaccinazione così come capire come patogeno anticorpo risposte sviluppano allergie e malattie autoimmuni. Non è banale generando risposte robusto dell’anticorpo antigene-specifiche. In modelli murini, spesso richiede più cicli di vaccinazioni con adiuvante che conduce ad una grande quantità di variabilità dei livelli di anticorpi indotti. Un esempio è in modelli murini di allergie arachidi dove modelli più robusti e riproducibile che riducono al minimo i numeri del mouse e l’uso dell’adiuvante sarebbe vantaggioso. Presentato qui è un modello murino altamente riproducibili di anafilassi allergia dell’arachide. Questo nuovo modello si basa su due fattori chiave: (1) antigene-specifici splenocytes passivamente vengono trasferiti da un mouse di arachidi-sensibilizzati in un ingenuo destinatario mouse, normalizzare il numero di memoria antigene-specifiche cellule di B e di T attraverso un gran numero di topi; e (2) destinatari topi sono successivamente potenziati con un forte immunogen multivalenti sotto forma di nanoparticelle liposomiale visualizzati l’allergene principale dell’arachide (Ara h 2). Il principale vantaggio di questo modello è la sua riproducibilità, che in ultima analisi, riduce il numero di animali utilizzati in ogni studio, riducendo al minimo il numero di animali che ricevono iniezioni multiple di adiuvante. L’assemblaggio modulare di questi liposomi immunogenici fornisce relativamente facile adattabilità ad altri modelli allergiche o autoimmuni che coinvolgono gli anticorpi patogeni.
Introduction
Allergia alimentare colpisce l’8% dei bambini negli Stati Uniti e ha aumentato in prevalenza negli ultimi dieci anni1. Allergia alle arachidi colpisce l’1% dei bambini e non è in genere sovrasviluppata2. Anche se parecchi test clinici promettenti sono in corso per il trattamento di allergia alimentare, tra cui l’immunoterapia orale (OIT), l’immunoterapia sublinguale (SLIT) e immunoterapia epicutaneous (EPIT), non ci sono attualmente senza strategie di trattamento approvato dalla FDA per desensibilizzazione individui allergici arachidi3,4,5,6,7,8. Di conseguenza, individui allergici devono rigorosamente evitare allergeni per evitare anafilassi. Molte domande rimangono riguardanti percorsi di sensibilizzazione e di base dei meccanismi di sviluppo di allergia alimentare.
Modelli murini sono uno strumento prezioso per lo studio dei meccanismi dell’allergia, nonché sviluppando nuove tollerogeniche e desensibilizzazione terapie9,10,11,12. Ciò è particolarmente vero perché l’allergene principale dell’arachide (Ara h 2; AH2) negli esseri umani è anche descritto l’allergene dominante in vari modelli del mouse13,14. Mentre i modelli murini dell’allergia dell’arachide sono preziosi per studiare i meccanismi della sensibilizzazione e della tolleranza, uno svantaggio è che può essere variabile e richiedono l’uso di adiuvanti. Immunogeni più potenti sarebbe un modo per ridurre al minimo la variabilità intrinseca di tali modelli. Dal momento che le cellule B sono fortemente attivate dagli antigeni multivalenti, liposomi antigenici visualizzati l’allergene sono una buona opzione a causa della loro capacità di attivare potenzialmente B-cellule attraverso il recettore delle cellule di B (BCR) mentre avendo anche la proprietà di efficiente adescamento il vano della T-cellula attraverso essere ripreso non specifico di antigene-presentare le cellule.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per coniugazione degli antigeni della proteina alle nanoparticelle liposomiale usando una strategia facile e modulare. Utilizzando un surrogato antigene, frammento Fab anti-IgM, dimostriamo come potente questi liposomi antigenici possono essere stimolante l’attivazione della B-cellula. Liposomi antigenici visualizzazione Ah2 antigene sono stati utilizzati per sviluppare un nuovo modello murino di sensibilità ha conferito. In questo modello, splenocytes dai topi di allergici alle arachidi verificati, contenente arachidi specifica memoria B – e T-cellule, vengono trasferiti in topi Congenici ingenuo. Le risposte dell’anticorpo di memoria sono indotti tramite l’iniezione di liposomi coniugato con Ah2 nei topi destinatari, al fine di indurre anticorpi contro Ah2. Seguita da un solo impulso con Ah2 solubile, anticorpi specifici Ah2 danno luogo a una forte risposta anafilattica quando questi topi sono successivamente impugnati con Ah2. Come topi sottoposti la reazione allergica rispondono in modo molto uniforme e non hanno ricevuto un adiuvante, questo approccio è un modello auspicabile allergia dell’arachide e i risultati suggeriscono che essa può avere utilità in altri modelli del mouse guidati dagli antigeni diretti a allergeni e, eventualmente, autoantigeni.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi descritti qui sono un protocollo generale per la coniugazione di una proteina di un lipide che consente la visualizzazione della proteina sulle nanoparticelle liposomiale. Per le proteine multi-unità secondaria molto grande, questo protocollo potrebbe aver limitato l’utilità. Il metodo ideale sarebbe l’introduzione di un tag site-specific che consente una strategia di collegamento chimico biortogonali essere utilizzato. Se esprimenti la proteina recombinantly, questo può essere possibile utilizzando strategie…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal dipartimento della difesa (W81XWH-16-1-0302 e W81XWH-16-1-0303).
Materials
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm – straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4X | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
References
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