חיתוך ושיטת צף בשביל לרקמות פרפין-מוטבע על חלוקתה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לשפר את חלוקתה פרפין. שיטה זו משלבת חיתוך צף באמצעות תא תרמוסטטי פשוטות כדי למנוע את תהליך ההעברה הנדרש על-ידי השיטה המקובלת. כתוצאה מכך, את היעילות ואת מספר קטעים שלמים פרפין היו השתפרה מאוד.
Abstract
חלוקתה של הרקמה פרפין-מוטבע הוא בשימוש נרחב כיום מגוון של פתולוגיה. עם זאת, מייגע. כדי לשפר את שיטה זו, מספר חברות מסחריות פיתחו מערכות העברת מקטע מורכבים באמצעות מים נוזלים. כדי לפשט את הטכנולוגיה הזאת, יצרנו שיטה פשוטה באמצעות ציוד ביתי המשלב הביתור ועל צף בתוך תא תרמוסטטי פשוטה; לכן, הסעיפים להזין באופן אוטומטי את המים הרותחים על פני המים. ההיפוקמפוס מוח העכבר למבוגרים, העכבר למבוגרים כליות, מוח העכבר מתחלקים, עיניים למבוגרים דג זברה נחתכו באמצעות חלוקתה הפרפין קונבנציונליים והן בשיטת הציג להשוואה. ניתוח סטטיסטי מראה שיפור השיטה שלנו הזמן שנחסך המיוצר חלקים באיכות גבוהה יותר. בנוסף, פרפין חלוקתה של הדגימה כל תוך זמן קצר קל עבור מפעילי ג’וניור.
Introduction
מחקר מורפולוגי חשוב במחקר הביולוגי. למרות הטכנולוגיה החדשה אפשרה לחוקרים לבחון את המטרות שלהם ישירות מן כל רקמות או אורגניזמים1,2,3, חיתוך הדגימה למקטעים דק, ואחריו מכתים, נשאר הראשית מורפולוגיה של רקמות היחיד של שיטה ולא לקחת כסף אבל גם חלבון מיקוד ישירות בתוך הרקמה. מיקרוסקופ אור עושה שימוש בשלושה סוגי המקטעים: פרפין, מוקפאים, ולא semithin. למרות cryosectioning נפוץ להגנה על רקמות antigenicity, הכנת הדגימה היא פשוטה, המורפולוגיה רקמות יתרת הוא עני, מצוייה דק אופטים4,5. פרפין חלוקתה היא השיטה השכיחה בתערוכה מורפולוגיה השתמרה היטב. דגימות הן מיובשת לגמרי, המוטבעות שעווה, ניתן לאחסן את אבני פרפין ללא הגבלת זמן. בנוסף, פרפין חלוקתה מייצרת חלקים דקים לשפר את הגישה בדיקה ביולוגית בניסויים נוספים ולהפחית תא כיסוי שכבת בכיוון Z.
עם זאת, חלוקתה הפרפין קונבנציונליים הוא מייגע, דורש מיומנות מפעיל. פרפין מקטעים לעבור קיבוע התייבשות, הטבעה, חותכים, צף. חשוב, העברת סרטים סעיף מהמחזיק סכין לאמבט מים הוא הכרחי, אבל קשה עבור מפעילי ג’וניור. בעיקר אוויר יבש, הסרטים סעיף חשל עקב חשמל סטטי ולכן קשה נפרשים על פני מים חמים. כדי לשפר את סעיף איכות, הרטבה השטח חשוף רקמות בין מיקרוטום להב מעברים, קירור הבלוקים השעווה הטבעית אותם במי קרח, או העלאת הלחות עם מכשיר לחות ליד האזמל הקטן מומלץ6,7 . שיטות חדשות לשיפור פרפין חלוקתה כוללים היברידית הטבעה פרפין, cryosectioning8ו מחלקה מסחרית העברת מערכת סיוע9. למרות השיטות לשפר באופן חלקי פרפין חלוקתה מהירות ואיכות, הם גורמים חלוקתה הרבה יותר מסורבלת, מערכות העברת מקטע מסחריים יקרים.
ב פרוטוקול זה, נדגים כיצד ליצור פשוט, זול וגמיש ציוד צעד אחר צעד, אשר ניתן לחבר בעל להב מיקרוטום רוטרי. ציוד זה כולל ערוץ סעיף באמבט מים, תנור עם מתג זיהוי טמפרטורה. לאחר חיתוך, עשרות סעיפים לזרום לתוך הערוץ מדור והזן את המים הרותחים ישירות, ובכך התגלגלות באופן אוטומטי. זה משפר את היעילות של פרפין חלוקתה, הופך את הטכנולוגיה הזו נוחה יותר. שימוש זו שיטה, הבוגרים יותר בעכבר מקטעים בהיפוקמפוס, העכבר למבוגרים כליות מקטעים, עובריים 15.5 מיושן (E15.5) העכבר המוח, ומקטעים עין דג זברה בוגרת מקטעים היו קוצרים בפחות זמן, נשארה יותר מורפולוגית. שיטה זו יכולה לשמש גם עבור דגימות רקמה אחרים הדורשים פרפין מואצת חלוקתה תוך הימנעות איבוד ההבחנה סעיף.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לשפר מורפולוגיה סעיף פרפין לפתור את הבעיה של זמן מבוזבז במהלך הפרפין קונבנציונליים חלוקתה, יצרנו של פרפין משופרת חלוקתה שיטה המשלבת חיתוך התגלגלות. שיטה משופרת זו מסתמכת על ציוד פשוטה שכוללת ערוץ סעיף, אמבט מים, תנור עם מתג זיהוי טמפרטורה. הכלים סעיף נכנס לאמבט מים דרך ערוץ סעיף, מתגלה …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (מענק מס 31400936, 31460260), את מדעי הטבע קרן של ג’יאנגשי פרובינציה של סין (20171BAB215020). אנו מודים גם את תוכנית משותפת בין אוניברסיטת נאנצ’אנג המלכה מרי אוניברסיטת לונדון לתמיכה עבודה זו.
Materials
| Incubator | Boekel Scientific | 133000-2 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 64-17-5 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 1330-20-7 | |
| Paraplast | Leica | 39601006 | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica | ||
| Commercial acrylic board | |||
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 67-66-3 | |
| Tubular electric heating element(12V 200W) | |||
| Temperature controller(12v 120w) | Mingsuo | XH-W3002 | |
| Rotary microtome | Leica | ||
| Neutral silicone sealant | Link the water channel with the microtome knife holder | ||
| Voltage transformer | Dearll | S-250-12 | |
| Disposable blade | Accu-Edge | 4689 | |
| Hematoxylin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Eosin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Microslide | Sail Brand | 7105 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 10004160 | |
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | |
| Microscope | Carl Zeiss | ||
| Hydrochloric acid | Xilong Chemical | 7647-01-0 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica | ||
| HistoCore Arcadia C - Cold Plate | Leica | ||
| paraffin repellent spray | Thermo Scientific | 9990420 |
References
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Fujita, S. Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography. Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (8), (2008).
- Viebahn, C., Luttenberg, H. P. A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).
- Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks. Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).
- Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
- Chen, T. K., et al. Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples. Journal of Visualized Experiments. (117), e54754 (2016).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles. Journal of Visualized Experiments. (46), e2438 (2010).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Whiteland, J. L., et al. Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus. Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).
- Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).
