Summary
Aquí se describe un protocolo para la producción de la cosecha las agujas que pueden utilizarse para recoger tejidos de la piel de espesor total sin causar donantes sitio marcar con una cicatriz. Las agujas pueden combinarse con un sistema de recolección simple para lograr la recolección de gran volumen.
Abstract
Este manuscrito describe el proceso de producción de un aparato de laboratorio, componentes estándar, que puede utilizarse para recoger microcolumns del tejido cutáneo de espesor total. El tamaño pequeño de la microcolumns permite que los donantes sitios curar rápidamente sin causar sitio dispensador de aceite marcar con una cicatriz, mientras cosecha tejido de grosor total permite la incorporación de todos los componentes celulares y extracelulares del tejido de la piel, los incluidos asociados con regiones dérmicas más profundas y las estructuras anexiales de la piel, que todavía tienen que ser reproducido con éxito utilizando la técnicas de ingeniería convencional. El microcolumns puede ser aplicado directamente en las heridas de la piel para aumentar la sanación, o pueden utilizarse como fuente de tejido autólogo de la célula de otros enfoques de ingeniería de tejidos. Las agujas de cosecha se hacen modificando agujas hipodérmicas estándar, y puede ser usados solo para cosechar pequeñas cantidades de tejido o combinados con un sistema de simple colección basada en succión (también hecho de suministros de laboratorio comúnmente disponibles) para alto volumen de la cosecha para facilitar los estudios en modelos animales grandes.
Introduction
Injerto de piel autólogo es la base de la reparación de la herida, pero está limitado por la escasez de sitio donante y la morbilidad, llevando a los esfuerzos en las últimas décadas para desarrollar nuevas opciones terapéuticas para reemplazar convencionales injertos de piel1,2 . Recientemente hemos desarrollado un método alternativo de recolección piel para aprovechar las ventajas del injerto de piel de grosor total reduciendo al mínimo morbosidad del sitio donante. Recogida de piel de grosor total en forma de pequeño (~0.5 mm de diámetro) "microcolumns", sitios dispensadores de aceite son capaces de sanar rápidamente y sin dejar cicatrices en circunstancias normales (para posibles excepciones, véase la sección discusión)3. Microcolumns puede ser aplicado directamente en camas de la herida para acelerar el cierre de la herida, reducir la contracción3y restaurar una amplia gama de tipos de células epidérmicas y dérmicas y las estructuras adnexal funcional4, muchos de los cuales carecen de injerto de piel del partir-grueso convencional o actual Bioingeniería de sustitutos de piel,5. La capacidad de microcolumns para aumentar la curación y de sus sitios de donantes a curar sin dejar cicatrices tanto sido independientemente validados por otros grupos de investigación6,7.
Previamente hemos desarrollado un sistema de recolección de laboratorio para permitir la colección de microcolumns en escala de8; sin embargo, este sistema se compone de muchos componentes modificados para requisitos particulares que no están ampliamente disponibles. Aquí, describimos en detalle el proceso de recolección de agujas, así como sistemas de recolección simple, sobre todo componentes estándar, que puede utilizarse para lograr alto volumen cosecha produciendo. El aparato descrito en este manuscrito es conveniente para la vitro y el trabajo animal, pero no para el uso en seres humanos. Un dispositivo clínico con autorización de la FDA para la aplicación de esta técnica en seres humanos está disponible en el mercado pero no se discutirá en detalle aquí.
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Protocol
Todo el trabajo con animales vivos y muestras de tejidos animales han sido aprobadas por el Massachusetts General Hospital institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC).
1. producción de la cosecha de agujas
- Configuración de la etapa de producción
- Asegure un conector luer hembra de cerradura en un poste y montar el post a un escenario de rotación para que la cerradura de luer está en el centro de la etapa (figura 1A).
- Esta primera etapa de la rotación de la posición vertical, montar y perpendicular a un escenario de segunda rotación horizontal (figura 1B).
- Montar la etapa horizontal de la rotación en una etapa de la traducción de dos ejes (figura 1B).
- Fije la combinación sobre una superficie estable, como una placa óptica.
- Por separado montar una herramienta giratoria sobre la misma placa, con la herramienta colocada en paralelo con la placa y en aproximadamente la misma altura que el conector de cierre luer en la etapa de combinación de rotación y traducción (figura 1C).
- Instalar dos discos de corte concéntrico en la herramienta rotatoria (un grano más pequeño, más bajo corte disco de diamante sobre un disco de piedra abrasivo de grano más grande, más alto) (figura 1D).
Nota: Sobre una 9 mm es suficiente diferencia entre los diámetros de las dos ruedas. - Posición de una luz cenital de la fuente con un brazo ajustable sobre la herramienta rotatoria, con la luz a las ruedas de corte.
- Para mejorar la visualización, coloque un microscopio de disección sobre la instalación de producción de modo que el ocular se enfoca en los discos de corte (figura 1C).
Nota: Como alternativa, los usuarios pueden usar gafas de aumento.
- Remodelación de la punta de la aguja
- Use gafas protectoras y una mascarilla quirúrgica para evitar que partículas metálicas en los ojos o vías respiratorias.
- Elegir el calibre de agujas hipodérmicas de la adecuada tamaño, basado en requisitos experimentales.
- Marque la longitud deseada en cada cosecha la aguja.
Nota: Para la recolección de piel porcina, agujas de 8 mm son normalmente suficientes; Aunque la longitud puede variar en función de necesidades experimentales (e.g., espesor del tejido de la piel blanco, tamaño de calibre de la aguja). Generalmente, una aguja de calibre 19 funciona bien para la piel porcina. - Baje la aguja perpendicular a la herramienta giratoria con el poder, utilizando el borde del disco de corte exterior que corte la longitud excesiva de la aguja, en el punto marcado en paso 1.2.3.
- Conecte la aguja acortada, Roma para el conector de cierre luer hembra en la etapa de producción.
- Ajustar la fase horizontal de la rotación para que la aguja esté en un ángulo de 12° paralelo a los discos de corte en la herramienta rotatoria (cambiando el ángulo de impacto la fuerza requerida para la inserción de la aguja).
- Encienda la luz cenital y ajustar su posición observando la aguja bajo aumento, hasta que la luz se refleja fuera de la línea media (longitudinal) de la aguja.
- Encienda la herramienta giratoria, después utiliza la etapa de la traducción para avanzar la aguja hacia el interior (diamante) corte disco (figura 2A).
- Mantener avanzando la aguja lentamente contra el disco de corte hasta que el disco alcanza aproximadamente la línea media de la aguja (según lo visualizado por la reflexión de la luz de arriba a lo largo de la línea media).
- Mueva lentamente la superficie de corte de la aguja desde el interior de la muela sobre la rueda exterior de piedra para terminar la superficie de corte de la aguja con un pulimento más fino (figura 2B).
- Retire la aguja del disco de corte.
- Con la etapa de rotación vertical, gire la aguja 180°.
- Repita los pasos 1.2.9-1.2.10 para cambiar la forma al otro lado de la aguja.
Nota: La aguja debe tener ahora dos puntas de corte de aproximadamente igual longitud (figura 2 y 2D). - Retire la aguja de la fase de producción.
- Limpiar el interior del alesaje con un alambre de metal es ligeramente más pequeño que el diámetro interno de la aguja.
- Usando un palo de madera afilado (e.g., partiendo del final del palo de madera pequeño en un aplicador de punta de algodón), elimine las rebabas que pueden estar todavía adheridas a los bordes de la aguja recién formado.
Nota: Las agujas puede ser electropulido y esterilizado por autoclave si fuera necesario.
2. tejidos de la piel
- Utilice las agujas cosecha para recoger la piel microcolumns de tejido ex vivo o animales vivos.
- Para ex vivo piel tejido fino (especialmente de las muestras donde la grasa subcutánea está faltando o fue recortada a), sostenga el tejido de la blanco sobre la abertura de un tubo de centrífuga de 50 mL, o apilar dos piezas de tejido uno encima del otro, para evitar dañar el n eedle consejos por golpes contra superficies duras.
Nota: Para la cosecha en vivo de animales vivos, se recomienda que la epinefrina y lidocaína local administrado por inyección intradérmica para la analgesia y reducir el sangrado. - Montar el aparato de recolección según la cantidad de microcolumns necesarios, como se describe a continuación.
- Opción de volumen bajo-medio:
- Para cosechar pequeñas a medianas cantidades de microcolumns, simplemente llenar una jeringa estándar (10-20 mL jeringas generalmente funcionan bien) con solución salina normal y conéctela a la aguja de recolección.
- Completamente Inserte la aguja de recolección en la piel del donante, luego lo retraiga.
- Empuje el émbolo de la jeringa descarga la solución salina a través de la aguja de recolección y expulsar la microcolumna que está alojado en el agujero de la aguja.
- Para acelerar el proceso de cosechando, repita el paso 2.4.2 3 a 5 veces antes de expulsar el microcolumns paso 2.4.3.
Nota: Normalmente es conveniente expulsar el microcolumns en un colador de célula estándar para facilitar la posterior colección de microcolumns. - Si las agujas se atascan, aumentar la presión sobre el émbolo para expulsar el tejido pegado y eliminar la obstrucción. Si simplemente aumentando la presión es insuficiente, alesaje de insertar un alambre de metal a través de la abertura de la punta de aguja para limpiar la obstrucción de la aguja.
- No microcolumns sumergidos en solución salina o medio hasta su uso para evitar la desecación.
Nota: Con un operador experimentado, puede utilizarse el método descrito anteriormente para la cosecha microcolumns a un ritmo de aproximadamente 1 microcolumna por segundo.
- Opción de alto volumen:
- Crear un simple dispositivo de succión-asistida que puede ser construido para facilitar la recolección de grandes cantidades de microcolumns.
Nota: El dispositivo consiste en una recolección aguja, jeringa de 20 mL con boquilla de cierre luer, adaptador aspiración típicamente utilizado para la liposucción (figura 3A) y frasco de aspiración estéril. - Retire el émbolo de la jeringa de 20 mL.
- Conectar la jeringa a un adaptador de succión.
- Completar el montaje colocando una cosecha aguja a la jeringa (figura 3B).
- Utilice un trozo de tubo de aspiración estéril para conectar el adaptador de succión a un recipiente estéril de aspiración. Asegúrese de que el aparato de recolección es conectado a la entrada de cilindro que permite el líquido en el recipiente sin trabas (que puede requerir conexión a un puerto del cartucho que está marcado para la salida en lugar de afluencia).
- Conecte el aparato a una fuente de presión negativa.
Nota: La presión necesaria depende de diámetro de la aguja y longitud, como se describió previamente8. Para el aparato descrito en este manuscrito, el sistema de aspiración en cuartos de funcionamiento típico es generalmente suficiente. - Conecte una cosecha aguja a la jeringa.
- Cosecha el microcolumns insertando la recolección de la aguja en la piel.
Nota: El microcolumns estará dibujado en la jeringa de succión, luego lavar en el tambor de succión. - Sumerja intermitentemente la aguja de recolección en un contenedor de solución salina estéril durante el procedimiento de recolección para limpiar el sistema.
Nota: Este rubor salino facilita el transporte de la microcolumna y asegura que hidratarse. Alternativamente, puede conectarse un adaptador luer MFF a la cerradura de luer de la jeringa y a través de un tubo de conexión, también con una bolsa de solución salina por goteo colgantes. - Tenga a mano un alambre de metal, o más pequeño medidor de aguja, que es ligeramente más pequeña que el diámetro interno de la aguja de recolección. Si la aguja se obstruye, puede borrarse introduciendo el alambre de metal en el orificio de la aguja.
- Cuando la cantidad deseada de microcolumns han acumulado en el cilindro, desconecte el dispositivo de succión, luego verter el contenido de la lata de succión hacia fuera a través de un filtro para recoger el microcolumns.
- Crear un simple dispositivo de succión-asistida que puede ser construido para facilitar la recolección de grandes cantidades de microcolumns.
- Después de la cosecha, aplique un ungüento antibiótico tópico sobre los sitios donantes.
Nota: Aderezos adicionales generalmente no son necesarios para sitios dispensadores de aceite.
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Representative Results
Las agujas de cosecha deben ser capaces de recoger microcolumns del tejido de piel de espesor total con aproximadamente un 80-90% de éxito, y debe contener cada microcolumna epidermis, dermis y algunas grasa subcutánea (figura 4). Si la tasa de éxito de la cosecha es baja, o si resulta difícil insertar una aguja en el tejido, luego una aguja nueva es probable que se necesita. Si la tasa de éxito para la cosecha es consistentemente baja, incluso con agujas nuevas, luego las agujas son probablemente demasiado cortas.
Si se usa en vivo, sitios dispensadores de aceite deben sanar rápidamente, como re-epithelialization ocurre típicamente dentro de algunos días3. Microcolumns puede aplicarse directamente para camas para aumentar3,4de cicatrización de la herida, o puede combinarse con materiales de matriz diferente a producir construcciones de combinación. Microcolumns también pueden mantenerse en cultivo en vitro estudios9.
Figura 1 : Aguja haciendo aparatos. (A) un conector luer macho asegurado a través de un poste de montaje en una etapa de rotación verticalmente colocado, de modo que el luer-lock está en el centro del escenario. (B) la fase de rotación vertical está montada perpendicular en una etapa de la segunda rotación horizontal (flecha negra). La etapa horizontal de la rotación se fija a una etapa de la traducción de dos ejes (flecha blanca). (C) colocación de la herramienta giratoria paralela a la placa (flecha blanca) y el microscopio de disección sobre el aparato de fabricación de la aguja (flecha roja). (D) discos de corte concéntricos montados en herramienta rotatoria, con un disco de diamante en su interior (flecha negra) y rueda de piedra en el exterior (flecha blanca). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Después de cortar la aguja a la longitud deseada, se utiliza la herramienta rotatoria para moler nuevas puntas de aguja. (A) en primer lugar, el disco de corte de diamante se utiliza para hacer cortes "burdos" para formar los nuevos consejos de corte y superficies. (B) después de que se forman las nuevas puntas de corte con el disco de diamante, la aguja se mueve a la rueda de piedra para pulido fino. (C) acabado vista desde el frente o (D) desde el lado de la aguja de la cosecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Montaje para la recolección de gran volumen. (A) componentes de la Asamblea, incluyendo (de izquierda a derecha) el adaptador de aspiración, jeringa de 20 mL con boquilla de cierre luer y aguja de recolección. (B) se muestra, es el montaje terminado, listo para conectar a fuente de presión negativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Piel representante microcolumns cosechados usando los aparatos descritos en este manuscrito. Cada microcolumna contiene la epidermis (1), dermis completa (2) y algunos grasa subcutánea (3). Marcas de verificación en la figura representan 1 mm. Esta figura ha sido modificada desde Tam et al. 4 según los términos de la correspondiente licencia de creative commons. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los métodos aquí descritos están diseñados para permitir la colección de tejido microcolumns en cantidades suficientes para en vivo grandes estudios con animales, utilizando herramientas de suministros de laboratorio disponibles en el mercado. Este aparato ha sido utilizado previamente en la recolección del tejido de piel humana suprimido4,9 como cerdos en piel3. Los parámetros específicos descritos son aquellos que fueron encontrados para ser más adecuado para su uso en cerdos. Se espera que el mismo aparato puede ser modificado y adaptado para la recogida de tejido de roedores y otros animales pequeños, pero esto no ha sido probado en nuestro laboratorio.
Pasos críticos en este protocolo incluyen asegurar las agujas de cosecha (cosecha ineficiente es generalmente debido a agujas de ser demasiado corta) de longitud suficiente, manteniendo la microcolumns sumergido en líquido durante el proceso de recolección para evitar desecación y limpiar el sistema con solución salina al menos intermitentemente (de lo contrario hay una mayor probabilidad de microcolumns obstruyendo el orificio de la aguja). La principal limitación de esta técnica es la velocidad; por ejemplo, en nuestra demostración, el aparato de succión-asistida generalmente puede cosechar 120 mg de tejido por minuto, que es suficiente para pequeñas heridas normalmente utilizados en animales de experimentación. Probablemente sería logísticamente difícil utilizar este enfoque para heridas muy grandes (por ej., en importante quemar modelos de lesión). Aguja de calibre es otra limitación - la aguja de calibre más pequeño, más susceptible es a pandeo, que es el modo de falla principal de esta técnica (por el contrario, la técnica es relativamente insensible a la aguja embotamiento durante el procedimiento). Para la piel porcina, utilizamos normalmente agujas de calibre 19, que son mecánicamente lo suficientemente robustas como para que raramente hebilla. Además, cada experiencia con animales (típicamente con sobre 3.000-5.000 microcolumns) generalmente requiere sólo 2 a 3 agujas. calibre 25 es el tamaño más pequeño de la aguja que hemos utilizado con esta técnica.
La capacidad de la piel pequeñas heridas para estimular la regeneración de los tejidos es el principio subyacente detrás de procedimientos clínicos como el láser fraccional repavimentación12 y microneedling13. Estos tratamientos son conocidos para mejorar la apariencia estética de foto-envejecimiento de la piel y más recientemente, demostrados para inducir la remodelación de la cicatriz y mejorar la función y estética de la piel cicatrices14,15. La extensa experiencia clínica con estas técnicas también proporciona más validación que la piel es capaz de curar sin dejar cicatrices después de estas microlesiones en la gran mayoría de los casos, con algunas excepciones (rejuvenecimiento con láser fraccional tiene según se informa una 3.8% de incidencia de cicatrización, casi siempre como resultado de infección16, destacando la importancia del cuidado de la piel posterior al procedimiento). Además, las personas con antecedentes de queloides o cicatrices hipertróficas pueden ser susceptibles a cicatrización incluso con estas lesiones más pequeñas; por lo tanto, los tratamientos que implican la producción de microlesiones pueden ser contraindicados.
Mientras que nuestras investigaciones anteriores se han centrado en aplicar directamente microcolumns en heridas de la piel para acelerar la cicatrización, la capacidad de recoger cantidades significativas de tejido sin causar otras morbilidades a largo plazo de la sitio donante (cicatrización, contractura, etc.) puede ser útil para una amplia gama de otras aplicaciones. Piel microcolumns puede servir como fuente de tejido para las concepciones que la expansión de la cultura o disociación y dispersión de células de piel autóloga10. Además, microcolumns proporcionan los beneficios adicionales de reducción al mínimo morbosidad del sitio donante e incluyendo tipos de la célula cutánea, tales como los asociados a las estructuras adnexal y las distintas poblaciones de células madre/progenitoras que residen en las partes más profundas de la DermIS11 (que no están disponibles con los métodos convencionales que utilizan la piel del partir-grueso como material de partida). Microcolumns autólogo puede también usarse en ensayos ex vivo para estudiar la respuesta del tejido a varios estímulos tales como los medicamentos o productos cosméticos en la que, a diferencia de la convencional célula ensayos de cultura, las estructuras celulares y extracelulares en cada microcolumna se mantienen en sus formatos de organización natural respectiva. Más generalmente, la microcolumna cosecha enfoque también puede ser ampliamente aplicable a proporcionar células autólogas y tejidos para los varios propósitos de la ingeniería regenerativa del tejido (para la piel y otros órganos), como el principio subyacente de pequeños donantes las heridas en curación completa y sin cicatrices es probable que sea generalizable a otros tipos de tejido.
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Disclosures
Los autores son co inventores patentes relacionadas con la técnica descrita en este artículo, de los cuales han recibido licencias y los ingresos de regalías a través de su institución, el Hospital General de Massachusetts. J. Tam también consulta de Medline Industries, Inc., que tiene la licencia comercial de esta tecnología.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por el ejército, la Marina, NIH, fuerza aérea, VA y asuntos de salud para apoyar el esfuerzo de afirmar II, bajo el no. de concesión W81XWH-13-2-0054. Los Estados Unidos Ejército investigación adquisición de actividad médica, 820 Chandler Street, Fort Detrick, MD 21702-5014 es la oficina de adquisición adjudicación y administradora. Opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las del autor y no necesariamente son endosadas por el Departamento de defensa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diamond wheel | Dremel | 545 | |
| Hypodermic needle (19G) | Fisher Scientific | 14-840-98 | Other needle sizes could be used, depending on experimental needs |
| Stone wheel | Dremel | 540 | |
| Syringe (20mL with luer lock) | Fisher Scientific | 22-124-967 | |
| Suction adapter | Tulip Medical | PA20BD | Optional, for high volume harvesting |
| Suction canister | Fisher Scientific | 19-898-212 | Optional, for high volume harvesting. Sterilize before use. |
| Suction tubing | Medline | DYND50216H | Optional, for high volume harvesting |
References
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