Primordiale kønsceller (PGCs) er fælles forløbere for både sæd og æg. Menneskelige embryonale PGCs er angivet fra pluripotente epiblast celler gennem interaktioner af cytokiner. Her beskriver vi en 13-dag protokol af inducerende menneskeceller transcriptomally ligner PGCs på overfladen af embryoid organer fra PRIMES-pluripotency induceret pluripotente stamceller.
Primordiale kønsceller (PGCs) er fælles forløbere for alle kønscelleoverførsel celler. I mus embryoner, er en stiftende befolkning på ~ 40 PGCs induceret fra pluripotente epiblast celler af orkestreret engagementer med cytokiner, herunder ben morfogenetiske proteiner 4 (Bmp4). I menneskelige embryoner, de tidligste PGCs er blevet identificeret på endodermal væggen af blommesækken omkring slutningen af 3rd uge af drægtigheden, men lidt er kendt om processen med menneskelige PGC specifikation og deres tidlige udvikling. For at omgå de tekniske og etiske barrierer for at studere menneskelige embryonale PGCs, har surrogat celle kultur modeller været for nylig genereret fra pluripotente stamceller. Her beskriver vi en 13-dag protokol for robust produktion af humane PGC-Like celler (hPGCLCs). Menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) vedligeholdes i tilstanden PRIMES pluripotency er udruget i 4i naive omprogrammering medium for 48 timer, dissocieres til enkelt celler og pakket ind i microwells. Langvarig vedligeholdelse af hiPSCs i den naive pluripotency stat forårsager betydelig kromosomforandringer og bør undgås. hiPSCs i microwells vedligeholdes for en yderligere 24 timer i form embryoid organer (EBs), som derefter 4i mellemlang kulturperler i lav-overholdelse af plasticware under en vuggende tilstand i hPGCLC induktion medie som indeholder en høj koncentration af rekombinant human BMP4. EBs er yderligere kulturperler i op til 8 dage i den vuggende, ikke-tilhænger betingelse for at opnå maksimalt udbytte af hPGCLCs. HPGCLCs registreres som immunhistokemi, let som celler kraftigt udtryk for OCT4 i næsten alle EBs udelukkende på deres overflade. Da EBs er enzymatisk adskilles og underkastes FACS berigelse, hPGCLCs kan afhentes som CD38 + celler med op til 40-45% udbytte.
Primordiale kønsceller (PGCs) er fælles forløbere for alle kønscelleoverførsel celler i begge køn. De fleste af vores viden om udvikling af PGCs i pattedyr embryoner er opnået gennem at studere laboratorium mus1,2. Embryonale dag 6.0-6.5 i mus embryoner, er 6 eller lignende mindre antal PGC prækursorer placeret i epiblast, og en stiftende befolkning på ~ 40 PGCs er induceret fra dem på en måde, der er afhængige af ben morfogenetiske proteiner, Bmp2 og Bmp4 udskilles fra tilstødende celler. De tidligste menneskelige PGCs hidtil identificeret i embryoner blev på endodermal væggen af blommesækken på omkring slutningen af den tredje uge af drægtigheden3. Fordi dette er det samme sted som overflytter PGCs er observeret i mus embryoner, er det sandsynligt, at de observerede menneskelige PGCs var i vejen for migration, men ikke den stiftende befolkning. Men undersøgelser sporing tilbage tidligere stadier af PGCs eller PGC prækursorer i menneskelige embryoner har manglet.
Adgang til menneskelige embryonale PGCs er udfordrende på grund af både tekniske og etiske forhindringer. For at overvinde disse forhindringer, har PGC-lignende celle kultur modeller været for nylig genereret fra humane pluripotente stamceller (PSC). Pluripotency er den cellulære evne til at differentiere i genom og tre embryonale kønscellers lag4. Der henviser til, at menneskers PSC’er vedligeholdes i mTeSR1 medium (en klar-til-brug, kommercielt tilgængelige medium formuleret til vedligeholdelse af menneskelige PSC’er i tilstanden PRIMES pluripotency) på retter belagt med det ekstracellulære matrix protein har PRIMES-state pluripotency 4, i 2013 Jacob Hanna lab viste at PRIMES pluripotency celler kan konverteres til en naiv pluripotency tilstand ved at udsætte til det naive menneskelige stamceller medium (NHSM) der indeholder kemiske hæmmere til protein kinaser ERK1/2, GSK3, LUCY, ROCK, PKC, og p38 MAPK samt vækstfaktorer LIF, TGF, bFGF5. Fra de naive-pluripotency menneskelige PSC’er, i 2015 gennemført en forskningsgruppe ledet af Hanna og Azim Surani første robust produktion af humane PGC-Like celler (hPGCLCs) fra PSC’er6. Senere, rapporteret flere andre laboratorier, herunder vores, generation af hPGCLCs fra kvikskrankerne ved hjælp af lidt forskellige protokoller7,8,9,10. Vores undersøgelse fremlagt bevis for at hPGCLCs genereret ved hjælp af forskellige protokoller (som er opsummeret i tabel S1 af vores tidligere offentliggjort undersøgelse10) er transcriptomally ligner hinanden10. Foreliggende beviser understøtter ligheden af menneskelige PGCLCs til nyuddannede menneskelige embryonale PGCs før den globale epigenetiske erasure7 og/eller kemotaktisk migration10.
Undersøgelser af mus embryonale PGCs, mus PGCLCs og menneskelige PGCLCs (men med kun meget begrænset adgang til menneskelige PGCs) har afsløret at molekylære mekanismer af PGC specifikation afviger betydeligt mellem mus og menneskelige1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. For eksempel, Prdm14 spiller vigtige roller i PGC specifikation i mus embryoner, men dens rolle i menneskelig PGC specifikation synes begrænset1,15. Derimod er induktion af SOX17 af EOMESODERMIN afgørende for PGC specifikation6,11,14, boer disse transkriptionsfaktorer synes undværes for musen PGC specifikation15. Disse første resultater af undersøgelser med hPGCLCs kraftigt støtter betydningen af denne celle kultur model som en surrogat af menneskelige embryonale PGCer.
Nyligt offentliggjorte undersøgelser, der involverer vores lab dyb sekventering evaluering af genomisk DNA kopi nummer analyse, har vist, at langvarig vedligeholdelse af PSC’er i tilstanden naive pluripotency betydeligt øger risikoen for kromosomale ustabilitet og strukturelle misdannelser. Dette fænomen blev observeret med både mus18 og menneskelige19 PSC’er. Den oprindelige hPGCLC produktion protokol rapporteret af Hanna/Pacôme blev udviklet til menneskelige PSC’er vedligeholdes i 4i naive pluripotency medium for mindst 2 uger6. For at bevare den normale diploide karyotype menneskelige PSC’er og PGCLCs, udviklede vi en modificeret protokol som menneskelige kvikskranker er udsat for 4i medium for kun 72 timer10, som er fremlagt i denne artikel. Menneskelige iPSCs (hiPSCs) vedligeholdes under PRIMES pluripotency staten. Umiddelbart før EB dannelse inkuberes cellerne i 4i naive omprogrammering medium (en modificeret NHSM medium) i 48 timer. Celler er derefter adskilles og pakket ind i microwells til at danne EBs et ekstra døgn i 4i medium. EBs er fastholdt i hPGCLC induktion medie som indeholder en høj koncentration af rekombinant human BMP4 under en vuggende betingelse for ikke-attachment kultur i op til 8 dage at få det maksimale udbytte af hPGCLCs. Efter 8 dages EB kultur, kan hPGCLCs være isoleret fra dissocierede EB celler af FACS som CD38 + celler med op til ~ 40% udbytte i FACS-sorterbare enkelt cellesuspension. Mens andre offentliggjort generere metoder7,8,9, herunder den originale protokol før vores ændringer6, typisk hPGCLCs i spontant dannede celle aggregater uden specifik lokalisering, hPGCLC produceret af vores protokol er observeret på overfladen af embryoid organer (EBs).
Robust produktion af hPGCLCs ved hjælp af protokollen beskrevet her blev bekræftet med tre uafhængige kloner af menneskelige iPSCs med normal diploide karyotype10. Disse iPSC kloner var afledt af den samme neonatal dermal menneskehud fibroblast celle kultur10. De vil blive leveret af forfatterne til denne artikel til efterforskere efter anmodning og under passende materialer overførsel aftale og shipping arrangement af frosne levende menneskeceller. Det er i øjeblikket uvist om hvorvidt normale karyotype er nødvendige for robust hPGCLC produktion ved hjælp af vores protokol eller dem, der indberettes af andre laboratorier.
Nylige undersøgelser har vist, at produktionen af hPGCLCs fra hiPSCs11 eller europæiske sektorråd14 ved hjælp af en protokol, der er beskrevet af Saitous gruppe af Kyoto University8 er afhængig af udtryk for EOMESODERMIN, kræves en T-box transkriptionsfaktor for Induktion af SOX17. SOX17 synes at fungere som master slægt afgørende transskription faktor i kønscelleoverførsel differentiering af humane pluripotente stamceller6. EOMESODERMIN er kodet af genet EOMES og CRISPR/Cas9 knockout af EOMES forårsaget næsten komplet fravær af SOX17 induktion i hPGCLC producerer betingelse11og udtryk for andre gener fulgt det samme mønster af den SOX17-null knockout celler. Overekspression af EOMESODERMIN fra en inducerbar vektor i EOMES-null knockout celler under hPGCLC induktion kultur effektivt reddet den robuste hPGCLC produktion samt induktion af kønscelleoverførsel gener, herunder SOX17. Derimod induceret overekspression SOX17 også reddet de robuste PGCLC produktion, men uden at fremkalde EOMES. Således, EOMESODERMIN er en kritisk opstrøms inducer af SOX17, og dette synes enkelt vigtigste rolle EOMESODERMIN i hPGCLC induktion fra humane pluripotente stamceller. Vores protokol inducerer SOX17 i hiPSCs10, men dens afhængighed af EOMESODERMINE induktion venter skal fastlægges.
Denne protokol konverterer primet pluripotency menneskelige iPSCs fastholdt i mTeSR1 medium til ERK-uafhængig naive pluripotency for 96 timer i 4i omprogrammering medium6, som er en modificeret naive menneskelige stamceller medium (NHSM)5. Vores forsøg på at generere hPGCLCs begyndende med de samme menneskelige iPSC kloner, men fastholdt i andre kommercielt tilgængelige menneskelige iPSC vækst medier før kultur i 4i omprogrammering medium resulterede i varierende grader af lavere hPGCLC udbytter. Selv om langsigtede tilpasning i andre medier forbedrer hPGCLC produktion eller ikke forbliver bestemmes i fremtidige undersøgelser, denne bemærkning tyder på, at nøjagtige tilstand af den PRIMES pluripotency af menneskelige iPSCs før 4i omprogrammering betydeligt nedslag EB dannelse i 4i medium og EB differentiering i hPGCLC medium.
Produktion af hPGCLCs fra hiPSCs efter vores protokol er robust og meget reproducerbar, dels på grund af brugen af de microwell plader, der giver effektiv produktionen af et stort antal EBs (~ 8.000 EBs pr. batch) med en ensartet størrelse (3.000 hiPSCs pr. EB). Antallet af EBs let produceret i en enkelt batch af eksperiment ved hjælp af vores protokol kan være langt større end metoder med regelmæssig U-nederste celle kultur brøndene. Produktion af et stort antal lige store EBs ensartet spækket med hPGCLCs kan give unikke muligheder for høj overførselshastighed kemiske screeninger til at identificere små molekylvægt aktivatorer eller påvirker PGC specifikation-hæmmere eller deres biologiske egenskaber såsom epigenetiske omprogrammering. Sådanne EBs kan også være nyttigt for toksikologiske vurderinger af stort antal kønscelleoverførsel celle giftige stoffer, herunder ikke kun miljøforurenende stoffer, men også klinisk ordineret medicin såsom kemoterapeutika.
De kritiske faktorer af robust og reproducerbare produktion af hPGCLCs ved hjælp af præsenteres protokollen omfatter (i) anvendelse af sunde hiPSCs fastholdt i mTeSR1 på ekstracellulære matrix protein, (ii) til podes nøjagtige antal celler som angivet og strengt Følg tider af medium forandring og subkultur, (iii) at vælge en god masse humane rekombinante BMP4, og (iv) at minimere fysiske skader af EBs under den vuggende kultur. Det er vores erfaring, at den bedste masse BMP4 reagens arbejdede ved 100 ng/mL koncentration, mens andre masse BMP4 reagenser kræves 2 X eller større doser. På anden side udbyttet af hPGCLCs produktion ved hjælp af den bedste masse BMP4 snarere faldt ved højere doser af BMP4 (fx 200 ng/mL). Vi anbefaler at teste flere forskellige masser af rekombinant human BMP4 reagenser fra flere leverandører af deres ydeevne ved at støtte hPGCLC generation og sikre en stor mængde af de bedste parti.
En unik feature i vores hPGCLC protokol er at hPGCLCs er lokaliseret på den yderste overflade lag af EBs10 (figur 8), mens andre protokoller kan generere hPGCLCs i midten af cellen aggregater6,8. Embryoid organer har tendens til at danne flere adskilte lag som overflade, yderstof, indre shell og kerne, og regionerne central kerne er ofte nekrotisk på grund af begrænsede udbud af næringsstoffer, ilt, samt pro-overlevende vækstfaktorer forudsat form kultur medium af diffusion20. Lokalisering af hPGCLCs på overfladen af EBs uden mulige begrænsninger på grund af begrænset udbredelse mod center EBs kan være gavnligt for direkte, tid – og dosis-kontrollerede eksponering af hPGCLCs stoffer eller giftige stoffer for farmakologiske eller toksikologiske undersøgelser.
Der henviser til, at mus PGCLCs Vis robust genome-wide DNA demetylering involverer prægning styre regioner i det mindste delvis synes7,19,20, graden af globale gDNA demetylering i hPGCLCs svagere end mus PGCLCS eller PGCs6,7. Transcriptomal profiler tyder på, at hPGCLCs kan ligne en tidligere fase af embryonale PGCs end mus PGCLCs10. Det er blevet rapporteret, at langvarig kultur af EBs under betingelse af hPGCLC produktion forårsaget en øget grad af gDNA demetylering7; men om en længere periode med kultur af hPGCLCs i EBs eller som isolerede celler kan opnå mere fremskredne stadier af kønscelleoverførsel differentiering skal bestemmes ved fremtidige undersøgelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Shiomi Yawata og Chie Owa til teknisk bistand under indledende undersøgelser. Denne undersøgelse blev støttet af NIEHS/NIH tilskud R01 ES023316 og R21ES024861 til TS, og stewardesse Medical Research Institute (FAMRI) tilskud til JHH.
Primed pluripotency hiPSC culture | |||
Matrigel | Corning | 354277 | Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21041-025 | Store at 4 °C. |
mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to 4 weeks without affecting cell culture performance. |
Y27632 | Axon | 1683 | Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C. |
CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | 07930 | Store at 4 °C. |
Accutase | Innovative cell technologies | AT104-500 | Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4i hiPSC culture | |||
KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1286101 | |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I1882-100MG | Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C. |
human LIF | PeproTech | 300-05 | Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C. |
human FGF2 | R&D Systems | 4114-TC | Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
4i basal medium | Mix the following reagents to make 4i basal medium. 500 mL of KnockOut DMEM 100 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 40 µL of 250 µg/mL human LIF 20 µl of 200 µg/ml human FGF2 4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1 Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C. |
||
CHIR99021 | Axon | 1386 | Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C. |
PD0325901 | Axon | 1408 | Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C. |
BIRB796 | Axon | 1358 | Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
SP600125 | Tocris | 1496 | Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
AggreWell400 | STEMCELL Technologies | 27845 | Microwell plate |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
hPGCLC culture | |||
Glasgow’s MEM | Thermo Fisher Scientific | 11710035 | |
Sodium pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
Penicillin-Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
hPGCLC basal medium | Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 500 mL of Glasgow’s MEM 75 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C. |
||
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C. |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C. |
Recombinant human BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C. |
Human SCF | PeproTech | 300-07 | Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C. |
Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C. |
Cell strainer | Corning | 352340 | Pore size = 40 μm. |
50 ml polypropylene conical tube | Corning | 352070 | |
Low attachment plate | Corning | 3471 | |
Vari-Mix Platform Rocker | Thermofisher | M79735Q | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunohistochemical staining | |||
BLOXALL Blocking Solution | VECTOR | SP-6000 | |
Normal Horse serum ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG |
VECTOR | MP-7405 | |
OCT-3/4 Antibody | Santa Cruz | SC-8629 | |
ImmPACT DAB | VECTOR | SK-4105 | |
Permount | Thermofisher | SP15-100 | Mounting medium |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isolating hPGCLC | |||
Embryoid Body Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-348 | |
Anti-CD38 antibody conjugated to APC | abcam | ab134399 |