Vi beskriver en protokol for etiket-fri identifikation af lymfocyt undertyper ved hjælp af kvantitative fase billeddiagnostik og en maskine læring algoritme. Målinger af 3D brydningsindeks Tomogrammer af lymfocytter præsenterer 3D morfologiske og biokemiske oplysninger for individuelle celler, som er derefter analyseret med en maskine-læring algoritme for identifikation af celletyper.
Vi beskriver her en protokol for etiket-fri identifikation af lymfocyt undertyper ved hjælp af kvantitative fase imaging og machine learning. Identifikation af lymfocyt undertyper er vigtige for studiet af immunologi samt diagnose og behandling af forskellige sygdomme. I øjeblikket, stole ensartede metoder til klassificering af lymfocyt typer på mærkning specifikke Membranproteiner via antigen-antistof reaktioner. Men disse mærkning teknikker medfører de potentielle risici ved at ændre cellulære funktioner. Protokollen beskrevet her overvinder disse udfordringer ved at udnytte iboende optisk kontraster målt ved 3D kvantitative fase billeddiagnostik og en maskine læring algoritme. Måling af 3D brydningsindeks (RI) Tomogrammer af lymfocytter giver kvantitative oplysninger om 3D morfologi og fænotyper af individuelle celler. De biofysiske parametre udvundet fra den målte 3D RI Tomogrammer analyseres derefter kvantitativt med en maskine læring algoritme, aktivering af label-fri identifikation af lymfocyt typer på en enkelt celle niveau. Vi måler den 3D RI Tomogrammer af B, CD4 + T og CD8 + T-lymfocytter og identificeret deres celletyper med over 80% nøjagtighed. I denne protokol beskriver vi detaljerede trin til lymfocyt isolation, 3D kvantitative fase imaging og machine learning til at identificere lymfocyt typer.
Lymfocytter kan inddeles i forskellige undertyper herunder B, helper (CD4 +) T cytotoksisk (CD8 +) T og regulerende T celler. Hver lymfocyt har en anden rolle i det adaptive immunsystem; for eksempel, producerer B-lymfocytter antistoffer, der henviser til, at T-lymfocytter opdage specifikke antigener, fjerne unormale celler og regulere B-lymfocytter. Lymfocyt funktion og regulering er stramt kontrolleret af og relateret til forskellige sygdomme herunder kræft1, autoimmune sygdomme2og virusinfektioner3. Identifikation af lymfocyt typer er således vigtigt at forstå deres patofysiologiske roller i sådanne sygdomme og for immunterapi i klinikker.
I øjeblikket, afhængige metoder til klassificering af lymfocyt typer antigen-antistof reaktioner ved at målrette specifikke overflade Membranproteiner eller celleoverflademarkører4. Målretning celleoverflademarkører er en præcis og nøjagtig metode til at bestemme lymfocyt typer. Det kræver dog dyrt reagenser og tidskrævende procedurer. Desuden, det bærer risikoen for ændring af membran proteinstrukturer og ændring af cellulære funktioner.
For at overvinde disse udfordringer, introducerer protokollen beskrevet her den etiket-fri identifikation af lymfocyt typer ved hjælp af 3D kvantitative fase imaging (QPI) og machine learning5. Denne metode gør det muligt for klassifikation af lymfocyt på en enkelt celle niveau baseret på morfologiske oplysninger fra etiket-gratis 3D billeddannelse af enkelte lymfocytter. I modsætning til konventionelle Fluorescens mikroskopi-teknikker udnytter QPI brydningsindeks (RI) distributioner (iboende optiske egenskaber af levende celler og væv) som optisk kontrast6,7. RI Tomogrammer af individuelle lymfocytter repræsenterer fænotypiske oplysninger specifikt for undertyper af lymfocytter. I dette tilfælde for at systemisk udnytte 3D RI Tomogrammer af individuelle lymfocytter, blev en overvåget maskinen læring algoritme udnyttet.
Bruger forskellige QPI teknikker, de 3D RI Tomogrammer af celler er blevet aktivt brugt til studie af celle Patofysiologi fordi de giver en etiket-fri, kvantitative imaging kapacitet8,9,10, 11,12,13. Også, de 3D RI distributioner af individuelle celler kan give morfologiske, biokemiske og Biomekanisk information om celler. 3D RI Tomogrammer tidligere har udnyttet inden for hæmatologi14,15,16,17, infektionssygdomme18,19, 20, immunologi21, celle biologi22,23, betændelse24, kræft25, neurovidenskab26,27, udviklingsmæssige biologi28, toksikologi 29og Mikrobiologi12,30,31,32.
Selv om 3D RI Tomogrammer give detaljerede oplysninger om morfologiske og biokemiske af celler, er klassificering af lymfocyt undertyper vanskeligt at opnå ved simpelthen imaging 3D RI Tomogrammer5. Systematisk og kvantitativt udnytte den målte 3D RI Tomogrammer for celle type klassificering, udnyttet vi en maskine læring algoritme. For nylig, flere værker er blevet rapporteret i hvilke kvantitative fase billeder af celler blev analyseret med forskellige machine learning algoritmer33, herunder påvisning af mikroorganismer34, klassificering af bakteriel slægten35 , 36, hurtig og etiket-fri påvisning af miltbrand sporer37, automatiseret analyse af sædceller38, analyse af kræft celler39,40, og påvisning af makrofag aktivering41.
Denne protokol giver detaljerede trin for at udføre etiket-fri identifikation af lymfocyt typer på den enkelte celle niveau ved hjælp af 3D QPI og machine learning. Dette omfatter: 1) lymfocyt isolation fra mus blod, 2) lymfocyt sortering via flow flowcytometri, 3) 3D QPI, 4) kvantitative funktion udvinding fra 3D RI Tomogrammer og 5) overvåget læring til at identificere lymfocyt typer.
Vi præsenterer en protokol, der gør det muligt for etiket-fri identifikation af lymfocyt typer at udnytte 3D kvantitative fase imaging og machine learning. Kritiske trin i denne protokol er kvantitative fase imaging og funktion udvalg. For den optimale holografisk imaging, bør tætheden af celler kontrolleres som beskrevet ovenfor. Mekanisk stabilitet af cellerne er også vigtigt at få en præcis 3D RI distribution, fordi flydende eller vibrationelle cellulære beslutningsforslag vil forstyrre hologram målinger på …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af KAIST BK21 + Program, Tomocube, Inc., og National Research Foundation Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo anerkender støtte fra KAIST Presidential Fellowship og Asan Foundation biomedicinsk videnskab legat.
Mouse | Daehan Biolink | C57BL/6J mice | gender and age-matched, 6 – 8 weeks |
Falcon conical centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | 15 mL |
Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | 806544-500ML | |
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10438018 | |
Antibody | BD Biosciences | 553140 (RRID:AB_394655) | CD16/32 (clone 2.4G2) |
Antibody | BD Biosciences | 555275 (RRID:AB_395699) | CD3ε (clone 17A2) |
Antibody | Biolegnd | 100734 (RRID:AB_2075238) | CD8α (clone 53-6.7) |
Antibody | BD Biosciences | 557655 (RRID:AB_396770) | CD19 (clone 1D3) |
Antibody | BD Biosciences | 557683 (RRID:AB_396793) | CD45R/B220 (clone RA3-6B2) |
Antibody | BD Biosciences | 552878 (RRID:AB_394507) | NK1.1 (clone PK136) |
Antibody | eBioscience | 11-0041-85 (RRID:AB_464893) | CD4 (clone GK1.5) |
DAPI | Roche | 10236276001 | 4,6-diamidino-2-phenylindole |
Flow cytometry | BD Biosciences | Aria II or III | |
Imaging chamber | Tomocube, Inc. | TomoDish | |
Holotomography | Tomocube, Inc. | HT-1H | |
Holotomography imaging software | Tomocube, Inc. | TomoStudio | |
Image professing software | MathWorks | Matlab R2017b |