JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Immunologie et infection

Etikett-fri identifikasjon av lymfocytt subtyper med tredimensjonale kvantitative fase Imaging og maskin læring

Published: November 19, 2018
doi:
10.3791/58305
, , , , , , ,
1Department of Physics,University of Cambridge, 2Department of Physics,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics,Stanford University

Summary

Vi beskriver en protokoll for etikett-fri identifikasjon av lymfocytt subtyper kvantitative fase bildebehandling og en maskinlæring algoritme. Målinger av 3D brytningsindeks tomograms av lymfocytter presenterer 3D morfologiske og biokjemiske informasjon for enkeltceller som analyseres deretter med en apparat-innlæring algoritme for identifikasjon av celletyper.

Abstract

Her beskriver vi en protokoll for etikett-fri identifikasjon av lymfocytt subtyper kvantitative fase bildebehandling og maskinlæring. Identifikasjon av lymfocytt subtyper er viktig for studiet av immunologi samt diagnose og behandling av ulike sykdommer. Foreløpig avhengige standard metoder for klassifisering lymfocytt merking bestemt membran proteiner via antigen-antistoff reaksjoner. Men bærer disse merking teknikker den potensielle risikoen ved å endre cellulære funksjoner. Protokollen beskrevet her overvinner disse utfordringene ved å utnytte innebygd optisk kontraster målt ved 3D kvantitative fase bildebehandling og en maskinlæring algoritme. Måling av 3D brytningsindeks (RI) tomograms av lymfocytter gir kvantitativ informasjon om 3D morfologi og fenotyper individuelle celler. De Biofysiske parameterne Hentet fra den målte 3D RI tomograms analyseres deretter kvantitativt med en maskin læring algoritme, aktivere etikett-fri identifikasjon av lymfocytt på en enkeltcelle nivå. Vi måle i 3D RI tomograms av B, CD4 + T og CD8 + T-lymfocytter og identifisert deres celletyper med over 80% nøyaktighet. I denne protokollen beskriver vi detaljerte trinn for lymfocytt isolasjon, 3D kvantitative fase bildebehandling og maskinlæring identifisere lymfocytt typer.

Introduction

Lymfocytter kan klassifiseres i ulike undergrupper inkludert B, hjelper (CD4 +) T, cytotoksiske (CD8 +) T og regulatoriske T celler. Hver lymfocytt har en annen rolle i det adaptive immunsystemet; for eksempel, produserer B-lymfocytter antistoffer, mens T-lymfocytter gjenkjenner bestemte antigener, fjerne unormale celler og regulere B-lymfocytter. Lymfocytt funksjon og regulering er tett kontrollert av og relatert til ulike sykdommer, inkludert kreft1, autoimmune sykdommer2og virusinfeksjoner3. Identifikasjon av lymfocytter er derfor viktig å forstå sine patofysiologiske roller i slike sykdommer og for immunterapi i klinikker.

Foreløpig avhengig metoder for klassifisering lymfocytt antigen-antistoff reaksjoner av målretting bestemte overflaten membran proteiner eller overflate markører4. Målretting overflate markører er en presis og nøyaktig metode for å bestemme lymfocytt typer. Men krever det dyre reagenser og tidkrevende prosedyrer. Videre bærer risikoen for endring av membran proteinstrukturer og endring av cellulære funksjoner.

For å overvinne disse utfordringene, introduserer protokollen beskrevet her etikett-fri identifikasjon av lymfocytt 3D kvantitative fase imaging (QPI) og maskinen lære5. Denne metoden gjør det mulig for klassifisering av lymfocytt typer på en enkeltcelle nivå basert på morfologiske informasjon fra etikett-gratis 3D-bildebehandling av personlige lymfocytter. I motsetning til konvensjonelle fluorescens mikroskopi teknikker benytter QPI brytningsindeks (RI) distribusjoner (innebygde optiske egenskaper av levende celler og vev) optisk kontrast6,7. RI tomograms av personlige lymfocytter representerer fenotypiske informasjon spesifikk for subtyper av lymfocytter. I dette tilfellet å systematisk bruke 3D RI tomograms av personlige lymfocytter, ble en veiledet maskin læring algoritmen benyttet.

Bruke ulike QPI teknikker, 3D RI tomograms celler er aktivt brukt for studiet av cellen patofysiologi fordi de gir en etikett-fri, kvantitativ imaging evne8,9,10, 11,12,13. 3D RI distribusjonen av enkeltceller kan også gi morfologiske biokjemiske og biomekaniske informasjon om celler. 3D RI tomograms har tidligere blitt utnyttet innen hematologi14,15,16,17, infeksjonssykdommer18,19, 20, immunologi21, cell biologi22,23, betennelse24, kreft25, nevrovitenskap26,27, utviklingsbiologi28, toksikologi 29og mikrobiologi12,30,31,32.

Selv om 3D RI tomograms gir detaljert morfologiske og biokjemiske informasjon av celler, er klassifiseringen av lymfocytt subtyper vanskelig å oppnå av bare imaging 3D RI tomograms5. Systematisk og kvantitativt utnytte den målte 3D RI tomograms for celle typeklassifisering, benyttet vi en maskin læring algoritme. Nylig har flere blitt rapportert i som kvantitative fase bilder av celler ble analysert med ulike maskin læring algoritmer33, inkludert påvisning av mikroorganismer34, klassifisering av bakterie-slekt35 , 36, rask og etikett-fri påvisning av anthrax sporer37, automatisk analyse av sædceller38, analyse av kreft celler39,40, og oppdagelsen av macrophage aktivisering41.

Denne protokollen gir detaljert fremgangsmåte for å utføre etikett-fri identifikasjon av lymfocytt typer enkeltcelle nivået med 3D QPI og maskinlæring. Dette inkluderer: 1) lymfocytt isolert fra mus blod, 2) lymfocytt sortering via flyt cytometri, 3) 3D QPI, 4) kvantitative egenskapsuttrekking fra 3D RI tomograms og 5) tilsyn læring for å identifisere lymfocytt typer.

Protocol

Dyr omsorg og eksperimentelle prosedyrer ble utført under godkjenning av institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen av KAIST (KA2010-21, KA2014-01 og KA2015-03). Alle eksperimenter i denne studien ble utført av godkjente retningslinjer. 1. lymfocytt isolert fra mus blod Når en C57BL/6J mus er euthanized via CO2 innånding, en 26-G nål inn musen hjertet og samle 0,3 mL blod. Direkte sette blod inn i et rør med 100 U/mL heparin-oppløsningen fortynnet med 1 mL av fosfa…

Representative Results

Figur 1 viser skjematisk prosessen med hele protokollen. Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, vi isolerte B (n = 149), CD4 + T (n = 95), og CD8 + T (n = 112) lymfocytter. For å få fase og amplitude informasjon i forskjellige vinkler av belysning, ble flere 2D hologrammer av hver lymfocytter målt ved å endre vinkelen på belysning (fra-60 ° til 60 °). Vanligvis 50 hologrammer kan brukes til å rekonstruere en 3D RI tomogram, men antall 2D hol…

Discussion

Vi presenterer en protokoll som etikett-fri identifikasjon av lymfocytt utnytte 3D kvantitative fase bildebehandling og maskinlæring. Avgjørende skritt i denne protokollen er kvantitative fase bildebehandling og funksjonen utvalg. For optimal holografiske avbilding, bør tetthet av celler kontrolleres som beskrevet ovenfor. Mekanisk stabilitet av cellene er også viktig å få en nøyaktig 3D RI distribusjon fordi flytende eller vibrasjonsmedisin mobilnettet bevegelser vil forstyrre hologrammet målinger på belysning …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av den arbeider nå som forsker BK21 + Program, Tomocube, Inc., og den nasjonale Research Foundation Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo anerkjenner støtte fra KAIST presidentvalget fellesskap og Asan Foundation biomedisinsk vitenskap stipend.

Materials

Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503 (2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14 (2010).
  3. Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (16), 6776-6781 (2007).
  4. Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105 (7), 2828-2835 (2005).
  5. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
  6. Popescu, G. . Quantitative phase imaging of cells and tissues. , (2011).
  7. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  8. Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. , 106328 (2017).
  9. Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2 (2), (2016).
  10. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1 (4), 153-156 (1969).
  11. Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046009 (2014).
  12. Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8 (3), 256 (2014).
  13. Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4 (4), 460-463 (2017).
  14. Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
  15. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
  17. Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
  18. Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
  19. Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
  20. Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6 (6), 20869 (2011).
  21. Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3865-3875 (2015).
  22. Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
  23. Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. , (2017).
  24. Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  25. Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  26. Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson’s disease. Cytometry Part A. 91 (5), 510-518 (2017).
  27. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
  28. Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8 (1), 210 (2017).
  29. Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
  30. Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. , (2016).
  31. Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (9), 7908-7917 (2017).
  32. Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  33. Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. , (2018).
  34. Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13 (12), 4492-4506 (2005).
  35. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23 (12), 15792-15805 (2015).
  36. Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
  37. Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3 (8), 1700606 (2017).
  38. Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91 (9), 893-900 (2017).
  39. Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91 (5), 482-493 (2017).
  40. Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. , (2017).
  41. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  42. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  43. Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72 (1), 156-160 (1982).
  44. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36 (23), 4677-4679 (2011).
  45. Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011005 (2013).
  46. Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15 (4), 1123-1132 (2015).
  47. Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8 (12), 5688-5697 (2017).
  48. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. , (2018).
  49. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (5), 2496-2518 (2017).

Tags

Label-freeLymphocyte Subtypes3D Quantitative Phase ImagingMachine LearningFluorescence LabelingFlow CytometryRefractive Index TomographyBlood CancerAutoimmune DiseaseSingle-cell AnalysisBacteria3D Quantitative Phase MicroscopeRPMI MediumDigital Micromirror Device3D Reconstruction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image