JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Etikett-fri identifiering av lymfocyter undertyper med hjälp av tredimensionell kvantitativ fas Imaging och Machine Learning

Published: November 19, 2018
doi:
10.3791/58305
, , , , , , ,
1Department of Physics,University of Cambridge, 2Department of Physics,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics,Stanford University

Summary

Vi beskriver ett protokoll för etikett-fri identifiering av lymfocyter subtyper använder kvantitativa fas imaging och en algoritm för maskininlärning. Mätningar av 3D brytningsindex tomograms av lymfocyter presentera 3D morfologiska och biokemiska information för enskilda celler, som sedan analyseras med en maskininlärning algoritmen för identifiering av celltyper.

Abstract

Här beskriver vi ett protokoll för etikett-fri identifiering av lymfocyter subtyper använder kvantitativa fas imaging och maskininlärning. Identifiering av lymfocyter subtyper är viktigt för studien av immunologi samt diagnos och behandling av olika sjukdomar. För närvarande, lita standardiserade metoder för klassificering av lymfocyter typer på märkning specifika membranproteiner via antigen-antikroppsreaktioner. Dock utföra dessa märkning tekniker de potentiella riskerna med att ändra cellulära funktioner. Protokollet beskrivs här övervinner dessa utmaningar genom att utnyttja inneboende optiska kontraster mätt med 3D kvantitativa fas imaging och en algoritm för maskininlärning. Mätning av 3D brytningsindex (RI) tomograms av lymfocyter ger kvantitativ information om 3D morfologi och fenotyper av enskilda celler. De biofysiska parametrar extraheras från den uppmätta 3D RI tomograms analyseras sedan kvantitativt med en maskin lärande algoritm, möjliggör etikett-fri identifiering av lymfocyter typer på en enskild cell-nivå. Vi mäter den 3D RI tomograms av B, T CD4 + och CD8 + T-lymfocyter och identifierat deras celltyper med över 80% noggrannhet. I detta protokoll beskriver vi de detaljerade anvisningarna för lymfocyter isolering, 3D kvantitativa fas imaging och maskininlärning för att identifiera lymfocyter typer.

Introduction

Lymfocyter kan delas in i olika subtyper inklusive B, helper (CD4 +) T, cytotoxiska (CD8 +) T och regulatoriska T celler. Varje typ av lymfocyter har en annan roll i det adaptiva immunsystemet; till exempel producerar B-lymfocyter antikroppar, medan T-lymfocyter upptäcka specifika antigener, eliminera onormala celler och reglera B-lymfocyter. Lymfocyter funktion och reglering är tätt kontrolleras av och relaterade till olika sjukdomar inklusive cancer1, autoimmuna sjukdomar2och virusinfektioner3. Identifiering av lymfocyter typer är därför viktigt att förstå deras patofysiologiska roller i sådana sjukdomar och för immunterapi i kliniker.

För närvarande beroende metoder för klassificering av lymfocyter typer antigen-antikroppsreaktioner genom att rikta specifika ytan membranproteiner eller yta markörer4. Inriktning yta markörer är en exakt och noggrann metod för att bestämma lymfocyter typer. Det kräver dock dyra reagenser och tidskrävande förfaranden. Dessutom medför det risker för ändring av protein membranstrukturer och förändringen av cellulära funktioner.

För att övervinna dessa utmaningar, införs i protokollet som beskrivs här etikett-fri identifiering av lymfocyter typer som använder 3D kvantitativa fas imaging (QPI) och machine learning-5. Denna metod möjliggör klassificering av lymfocyter typer på en enskild cell nivå baserat på morfologiska informationsutdrag från etikett-gratis 3D imaging av enskilda lymfocyter. Till skillnad från konventionella fluorescence mikroskopi tekniker använder QPI brytningsindex (RI) distributioner (inneboende optiska egenskaper av levande celler och vävnader) som optiska kontrast6,7. De RI tomograms av enskilda lymfocyter utgör fenotypiska information specifik för subtyper av lymfocyter. I det här fallet för att systemiskt utnyttja 3D RI tomograms av enskilda lymfocyter, utnyttjades en övervakad dator lärande algoritm.

Använda olika QPI tekniker, de 3D RI tomograms celler har aktivt använts för studier av cell patofysiologi eftersom de ger en etikett-fri, kvantitativa imaging kapacitet8,9,10, 11,12,13. Också, de 3D RI-distributionerna av enskilda celler kan ge morfologiska, biokemiska och biomekaniska information om celler. 3D RI tomograms använts tidigare inom hematologi14,15,16,17, infektionssjukdomar18,19, 20, immunologi21, cellbiologi22,23, inflammation24, cancer25, neurovetenskap26,27, utvecklingsbiologi28, toxikologi 29och mikrobiologi12,30,31,32.

Även om 3D RI tomograms ger detaljerad information om morfologiska och biokemiska celler, är klassificering av lymfocyter subtyper svårt att uppnå genom att helt enkelt imaging 3D RI tomograms5. Kvantitativt och systematiskt utnyttja den uppmätta 3D RI tomograms för klassificeringen av cellen, utnyttjade vi en maskin lärande algoritm. Nyligen, flera verk har rapporterats i vilka kvantitativa fasen analyserades bilder av celler med olika maskininlärning algoritmer33, inklusive upptäckt av mikroorganismer34, klassificering av bakteriesläkte35 , 36, etikett-gratis och snabb påvisande av mjältbrand sporer37, automatiserad analys av spermacellerna38, analys av cancer celler39,40, och upptäckt av makrofag aktiveringen41.

Detta protokoll ger detaljerade steg för att utföra etikett-fri identifiering av lymfocyter typer på enskild cellnivå använder 3D QPI och maskininlärning. Detta omfattar: (1) lymfocyter isolering från mus blod, 2) lymfocyter sortering via flöde flödescytometri, 3) 3D QPI, 4) kvantitativa funktionen utvinning från 3D RI tomograms och 5) övervakade lärande för att identifiera lymfocyter typer.

Protocol

Djurvård och experimentella rutiner utfördes under godkännande av institutionella djur vård och användning kommittén för KAIST (KA2010-21 KA2014-01 och KA2015-03). Alla experimenten i denna studie genomfördes i enlighet med de godkända riktlinjerna. 1. lymfocyter isolering från mus blod När en C57BL/6J mus är euthanized via CO2 inandning, infoga en 26-G nål in i musen hjärtat och samla 0,3 mL blod. Direkt sätta blod i en tub med 100 U/mL heparin lösning sp?…

Representative Results

Figur 1 visar schematiskt processen i hela protokollet. Använda proceduren presenteras här, vi isolerat B (n = 149), CD4 + T (n = 95), och CD8 + T (n = 112) lymfocyter. För att få informationen om huvudaktivitet och amplitud i olika vinklar av belysning, mättes flera 2D hologram av varje lymfocyter genom att ändra vinkeln på belysningen (från-60 ° till 60 °). Vanligtvis, 50 hologram kan användas för att rekonstruera en 3D RI-tomogram, men anta…

Discussion

Vi presenterar ett protokoll som möjliggör etikett-fri identifiering av lymfocyter typer att utnyttja 3D kvantitativa fas imaging och maskininlärning. Kritiska steg i detta protokoll är kvantitativa fas imaging och funktionen urval. För den optimala holographic imaging kontrolleras tätheten av celler enligt ovan. Mekanisk stabilitet av cellerna är också viktigt att få en exakt 3D RI distribution eftersom flytande eller vibrerande cellulära motioner kommer att störa hologram mätningar vid belysning vinkel för…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av den KAIST BK21 + Program, Tomocube, Inc., och National Research Foundation Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo erkänner stöd från KAIST Presidential gemenskap och Asan Foundation biomedicinsk vetenskap stipendium.

Materials

Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503 (2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14 (2010).
  3. Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (16), 6776-6781 (2007).
  4. Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105 (7), 2828-2835 (2005).
  5. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
  6. Popescu, G. . Quantitative phase imaging of cells and tissues. , (2011).
  7. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  8. Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. , 106328 (2017).
  9. Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2 (2), (2016).
  10. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1 (4), 153-156 (1969).
  11. Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046009 (2014).
  12. Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8 (3), 256 (2014).
  13. Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4 (4), 460-463 (2017).
  14. Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
  15. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
  17. Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
  18. Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
  19. Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
  20. Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6 (6), 20869 (2011).
  21. Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3865-3875 (2015).
  22. Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
  23. Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. , (2017).
  24. Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  25. Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  26. Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson’s disease. Cytometry Part A. 91 (5), 510-518 (2017).
  27. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
  28. Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8 (1), 210 (2017).
  29. Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
  30. Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. , (2016).
  31. Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (9), 7908-7917 (2017).
  32. Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  33. Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. , (2018).
  34. Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13 (12), 4492-4506 (2005).
  35. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23 (12), 15792-15805 (2015).
  36. Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
  37. Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3 (8), 1700606 (2017).
  38. Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91 (9), 893-900 (2017).
  39. Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91 (5), 482-493 (2017).
  40. Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. , (2017).
  41. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  42. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  43. Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72 (1), 156-160 (1982).
  44. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36 (23), 4677-4679 (2011).
  45. Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011005 (2013).
  46. Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15 (4), 1123-1132 (2015).
  47. Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8 (12), 5688-5697 (2017).
  48. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. , (2018).
  49. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (5), 2496-2518 (2017).

Tags

Label-freeLymphocyte Subtypes3D Quantitative Phase ImagingMachine LearningFluorescence LabelingFlow CytometryRefractive Index TomographyBlood CancerAutoimmune DiseaseSingle-cell AnalysisBacteria3D Quantitative Phase MicroscopeRPMI MediumDigital Micromirror Device3D Reconstruction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image