JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Etiket içermeyen lenfosit alt türlerinden üç boyutlu nicel faz Imaging'i kullanma tanımlaması ve öğrenme makine

Published: November 19, 2018
doi:
10.3791/58305
, , , , , , ,
1Department of Physics,University of Cambridge, 2Department of Physics,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics,Stanford University

Summary

Biz lenfosit alt türlerinden nicel faz görüntüleme ve bir makine öğrenimi algoritması kullanarak etiket içermeyen tanımlaması için bir iletişim kuralı tanımlamak. 3D kırılma indisi tomograms lenfositlerin ölçümleri sonra hücre tiplerinin tanımlanması için bir makine-öğrenme algoritması ile analiz edilir 3D morfolojik ve biyokimyasal bilgilerini tek tek hücreler, mevcut.

Abstract

Biz burada nicel faz görüntüleme ve makine öğrenimi kullanarak lenfosit alt etiket içermeyen tanımlaması için bir iletişim kuralı tanımlamak. Kimlik lenfosit alt türlerinden İmmünoloji yanı sıra tanı, çalışma ve çeşitli hastalıkların tedavisi için önemlidir. Şu anda, standart yöntemlerini lenfosit türleri sınıflandırmak için belirli zar proteinleri antijen-antikor reaksiyonlar ile etiketleme güveniyor. Ancak, bu etiketleme teknikleri hücresel işlevlerini değiştirme potansiyel riskleri taşır. Burada açıklanan protokol 3D nicel faz görüntüleme ve bir makine öğrenimi algoritması tarafından ölçülen içsel optik tezat sömürerek bu zorlukların üstesinden gelir. 3D kırılma indisi (RI) tomograms lenfositlerin ölçümü 3D Morfoloji ve tek tek hücreler fenotipleri hakkında kantitatif bilgi sağlar. Ölçülen 3D RI tomograms çıkarılan biyofiziksel parametreleri kantitatif etiket içermeyen tanımlaması lenfosit türleri bir tek hücre düzeyinde etkinleştirme bir makine öğrenme algoritması ile incelenir. Biz 3D RI tomograms B, T CD4 + ve CD8 + T lenfositler ölçmek ve onların hücre tipleri ile % 80’den fazla tespit doğruluk. Bu protokol için lenfosit yalıtım, 3D nicel faz görüntüleme ve lenfosit türlerini tanımlamak için makine öğrenimi için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır.

Introduction

Lenfositler B, yardımcı (CD4 +) T, sitotoksik (CD8 +) T ve düzenleyici T de dahil olmak üzere çeşitli alt türleri gizli hücreleri. Lenfosit türlerinin farklı bir rol içinde edinilmiş bağışıklık sistemi vardır; Örneğin, T lenfositler belirli antijenleri tespit etmek, anormal hücreler ortadan kaldırmak ve B lenfositler düzenleyen oysa B lenfositler antikor, üretmek. Lenfosit fonksiyon ve yönetmelik sıkıca tarafından kontrol ve kanser1, otoimmün hastalıklar2ve viral enfeksiyonlar3de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar ile ilgili. Böylece, lenfosit türleri tanımlaması gibi hastalıklar ve immünoterapi kliniklerde patofizyolojik rollerini anlamak önemlidir.

Şu anda, yöntemlerini lenfosit türleri sınıflandırmak için belirli yüzey membran proteinlerinin veya yüzey işaretleyicileri4hedefleyerek antijen-antikor reaksiyonlar güveniyor. Yüzey işaretleyicileri hedefleme lenfosit türlerini belirlemek için kesin ve doğru bir yöntemdir. Ancak, pahalı reaktifler ve zaman alıcı yordamlara ihtiyaç duyar. Ayrıca, membran protein yapıları değişiklik ve tadilat hücresel fonksiyonların riskleri taşır.

Bu zorlukları aşmak için burada açıklanan protokol lenfosit türleri (QPI) düşsel 3D nicel faz ve5öğrenme makine kullanarak etiket içermeyen tanımlaması tanıtır. Bu yöntem, bireysel lenfositler etiket ücretsiz 3D görüntüleme dan çıkarılan morfolojik bilgilere dayanarak bir tek hücre düzeyinde lenfosit türleri sınıflandırılması sağlar. Geleneksel floresan mikroskopi teknikleri QPI kırılma indisi (RI) dağılımları (canlı hücre ve dokuların Iç optik özellikleri) optik kontrast6,7olarak kullanır. RI tomograms bireysel lenfositlerin lenfosit alt türleri için özel fenotipik bilgileri temsil eder. Bu durumda, sistemik 3D RI tomograms bireysel lenfositlerin yararlanmak için denetimli makine öğrenme algoritması kullanılmıştır.

Etiket içermeyen, sağladıkları çeşitli QPI teknikler kullanarak, 3D RI tomograms hücre aktif hücre patofizyolojisi çalışma için kullanılmış olan sayısal görüntüleme yeteneği8,9,10, 11,12,13. Ayrıca, tek tek hücreleri 3D RI dağılımları morfolojik, biyokimyasal ve biyomekanik hücreler hakkında bilgi sağlar. 3D RI tomograms daha önce kullanılan alanların Hematoloji14,15,16,17, bulaşıcı hastalıklar18,19, 20, immünoloji21, hücre biyolojisi22,23, iltihap24, kanser25, nörolojik26,27, gelişim biyolojisi28, toksikoloji 29ve Mikrobiyoloji12,30,31,32.

3D RI tomograms detaylı morfolojik ve biyokimyasal bilgilerini hücre sağlasa, sınıflandırma lenfosit alt türlerinden sadece 3D RI tomograms5Imaging tarafından elde etmek zordur. Sistematik ve kantitatif ölçülen 3D RI tomograms Cep tipi sınıflandırma için yararlanmak için bir makine öğrenme algoritması kullanılmıştır. Son zamanlarda, çeşitli eserler nicel hangi aşamada hücreleri görüntülerini analiz edildi öğrenme algoritmaları33mikroorganizmaların34, bakteriyel cins35 sınıflandırılması tespiti de dahil olmak üzere, çeşitli makine ile bildirilmiştir , 36, şarbon sporları37, hızlı ve etiket içermeyen tespiti otomatik analizi sperm hücresi38, kanser hücreleri39,40Analizi ve tespiti makrofaj harekete geçirmek41.

Bu iletişim kuralı etiket içermeyen tanımlaması lenfosit türleri, 3D QPI ve makine öğrenimi kullanılarak tek tek hücre düzeyinde uygulanacak ayrıntılı adımları sağlar. Bu içerir: 1) lenfosit yalıtım fare kan, 2) lenfosit akış sitometresi, 3) 3D QPI, 4) kantitatif Özellik çekme–dan 3D RI tomograms üzerinden sıralama ve lenfosit türlerini tanımlamak için 5) denetimli öğrenme.

Protocol

Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler kurumsal hayvan bakım ve kullanım KAIST Komitesi (KA2010-21, KA2014-01 ve KA2015-03) onay altında yapıldı. Bu çalışmada tüm deneylerin onaylı kılavuzlarınıza uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. lenfosit izolasyon fare kan C57BL/6J fare CO2 inhalasyon yolu ile ötenazi, 26-G iğne fare kalp içine yerleştirin ve 0.3 mL kan toplamak. Doğrudan kan fosfat tamponlu tuz (PBS) ile 1 mL sulandırılmış 100 U/mL heparin…

Representative Results

Şekil 1 tüm iletişim kuralı şematik süreci gösterir. Burada sunulan yordamını kullanarak B izole (n = 149), CD4 + T (n 95 =) ve CD8 + T (n = 112) lenfositler. Aydınlatma çeşitli açılarda faz ve genlik bilgilerini elde etmek için her lenfosit birden fazla 2D hologramlar (den-60 ° ile 60 °) aydınlatma açısını değiştirerek ölçüldü. Genelde 50 hologramlar 3D RI tomogram yeniden oluşturmak için kullanılan, ancak görüntüleme h?…

Discussion

Biz mevcut 3D nicel faz görüntüleme ve makine öğrenimi istismar lenfosit türleri etiket içermeyen tanımlaması etkinleştiren bir iletişim kuralıdır. Bu protokol kritik adım nicel faz görüntüleme ve Özellik seçimi vardır. En iyi holografik görüntüleme için hücre yoğunluğu yukarıda açıklandığı gibi kontrol edilmesi gerekmektedir. Hücrelerin mekanik sağlamlık da yüzen veya titreşim hücresel hareketleri aydınlatma açısı değişiklikleri üzerine hologram ölçümleri rahatsız etmeye…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser KAIST BK21 + Program, Tomocube, Inc ve Ulusal Araştırma Vakfı Kore (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018 K 000396) tarafından desteklenmiştir. Y. Jo KAIST başkanlık Bursu ve Asan Vakfı Biyomedikal Bilim bursu destek kabul eder.

Materials

Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503 (2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14 (2010).
  3. Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (16), 6776-6781 (2007).
  4. Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105 (7), 2828-2835 (2005).
  5. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
  6. Popescu, G. . Quantitative phase imaging of cells and tissues. , (2011).
  7. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  8. Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. , 106328 (2017).
  9. Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2 (2), (2016).
  10. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1 (4), 153-156 (1969).
  11. Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046009 (2014).
  12. Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8 (3), 256 (2014).
  13. Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4 (4), 460-463 (2017).
  14. Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
  15. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
  17. Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
  18. Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
  19. Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
  20. Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6 (6), 20869 (2011).
  21. Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3865-3875 (2015).
  22. Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
  23. Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. , (2017).
  24. Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  25. Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  26. Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson’s disease. Cytometry Part A. 91 (5), 510-518 (2017).
  27. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
  28. Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8 (1), 210 (2017).
  29. Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
  30. Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. , (2016).
  31. Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (9), 7908-7917 (2017).
  32. Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  33. Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. , (2018).
  34. Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13 (12), 4492-4506 (2005).
  35. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23 (12), 15792-15805 (2015).
  36. Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
  37. Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3 (8), 1700606 (2017).
  38. Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91 (9), 893-900 (2017).
  39. Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91 (5), 482-493 (2017).
  40. Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. , (2017).
  41. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  42. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  43. Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72 (1), 156-160 (1982).
  44. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36 (23), 4677-4679 (2011).
  45. Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011005 (2013).
  46. Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15 (4), 1123-1132 (2015).
  47. Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8 (12), 5688-5697 (2017).
  48. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. , (2018).
  49. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (5), 2496-2518 (2017).

Tags

Label-freeLymphocyte Subtypes3D Quantitative Phase ImagingMachine LearningFluorescence LabelingFlow CytometryRefractive Index TomographyBlood CancerAutoimmune DiseaseSingle-cell AnalysisBacteria3D Quantitative Phase MicroscopeRPMI MediumDigital Micromirror Device3D Reconstruction
check_url/fr/58305?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image