JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Immunologie et infection

Label-gratis identifikation af lymfocyt undertyper ved hjælp af tre-dimensionelle kvantitative fase Imaging og Machine Learning

Published: November 19, 2018
doi:
10.3791/58305
, , , , , , ,
1Department of Physics,University of Cambridge, 2Department of Physics,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics,Stanford University

Summary

Vi beskriver en protokol for etiket-fri identifikation af lymfocyt undertyper ved hjælp af kvantitative fase billeddiagnostik og en maskine læring algoritme. Målinger af 3D brydningsindeks Tomogrammer af lymfocytter præsenterer 3D morfologiske og biokemiske oplysninger for individuelle celler, som er derefter analyseret med en maskine-læring algoritme for identifikation af celletyper.

Abstract

Vi beskriver her en protokol for etiket-fri identifikation af lymfocyt undertyper ved hjælp af kvantitative fase imaging og machine learning. Identifikation af lymfocyt undertyper er vigtige for studiet af immunologi samt diagnose og behandling af forskellige sygdomme. I øjeblikket, stole ensartede metoder til klassificering af lymfocyt typer på mærkning specifikke Membranproteiner via antigen-antistof reaktioner. Men disse mærkning teknikker medfører de potentielle risici ved at ændre cellulære funktioner. Protokollen beskrevet her overvinder disse udfordringer ved at udnytte iboende optisk kontraster målt ved 3D kvantitative fase billeddiagnostik og en maskine læring algoritme. Måling af 3D brydningsindeks (RI) Tomogrammer af lymfocytter giver kvantitative oplysninger om 3D morfologi og fænotyper af individuelle celler. De biofysiske parametre udvundet fra den målte 3D RI Tomogrammer analyseres derefter kvantitativt med en maskine læring algoritme, aktivering af label-fri identifikation af lymfocyt typer på en enkelt celle niveau. Vi måler den 3D RI Tomogrammer af B, CD4 + T og CD8 + T-lymfocytter og identificeret deres celletyper med over 80% nøjagtighed. I denne protokol beskriver vi detaljerede trin til lymfocyt isolation, 3D kvantitative fase imaging og machine learning til at identificere lymfocyt typer.

Introduction

Lymfocytter kan inddeles i forskellige undertyper herunder B, helper (CD4 +) T cytotoksisk (CD8 +) T og regulerende T celler. Hver lymfocyt har en anden rolle i det adaptive immunsystem; for eksempel, producerer B-lymfocytter antistoffer, der henviser til, at T-lymfocytter opdage specifikke antigener, fjerne unormale celler og regulere B-lymfocytter. Lymfocyt funktion og regulering er stramt kontrolleret af og relateret til forskellige sygdomme herunder kræft1, autoimmune sygdomme2og virusinfektioner3. Identifikation af lymfocyt typer er således vigtigt at forstå deres patofysiologiske roller i sådanne sygdomme og for immunterapi i klinikker.

I øjeblikket, afhængige metoder til klassificering af lymfocyt typer antigen-antistof reaktioner ved at målrette specifikke overflade Membranproteiner eller celleoverflademarkører4. Målretning celleoverflademarkører er en præcis og nøjagtig metode til at bestemme lymfocyt typer. Det kræver dog dyrt reagenser og tidskrævende procedurer. Desuden, det bærer risikoen for ændring af membran proteinstrukturer og ændring af cellulære funktioner.

For at overvinde disse udfordringer, introducerer protokollen beskrevet her den etiket-fri identifikation af lymfocyt typer ved hjælp af 3D kvantitative fase imaging (QPI) og machine learning5. Denne metode gør det muligt for klassifikation af lymfocyt på en enkelt celle niveau baseret på morfologiske oplysninger fra etiket-gratis 3D billeddannelse af enkelte lymfocytter. I modsætning til konventionelle Fluorescens mikroskopi-teknikker udnytter QPI brydningsindeks (RI) distributioner (iboende optiske egenskaber af levende celler og væv) som optisk kontrast6,7. RI Tomogrammer af individuelle lymfocytter repræsenterer fænotypiske oplysninger specifikt for undertyper af lymfocytter. I dette tilfælde for at systemisk udnytte 3D RI Tomogrammer af individuelle lymfocytter, blev en overvåget maskinen læring algoritme udnyttet.

Bruger forskellige QPI teknikker, de 3D RI Tomogrammer af celler er blevet aktivt brugt til studie af celle Patofysiologi fordi de giver en etiket-fri, kvantitative imaging kapacitet8,9,10, 11,12,13. Også, de 3D RI distributioner af individuelle celler kan give morfologiske, biokemiske og Biomekanisk information om celler. 3D RI Tomogrammer tidligere har udnyttet inden for hæmatologi14,15,16,17, infektionssygdomme18,19, 20, immunologi21, celle biologi22,23, betændelse24, kræft25, neurovidenskab26,27, udviklingsmæssige biologi28, toksikologi 29og Mikrobiologi12,30,31,32.

Selv om 3D RI Tomogrammer give detaljerede oplysninger om morfologiske og biokemiske af celler, er klassificering af lymfocyt undertyper vanskeligt at opnå ved simpelthen imaging 3D RI Tomogrammer5. Systematisk og kvantitativt udnytte den målte 3D RI Tomogrammer for celle type klassificering, udnyttet vi en maskine læring algoritme. For nylig, flere værker er blevet rapporteret i hvilke kvantitative fase billeder af celler blev analyseret med forskellige machine learning algoritmer33, herunder påvisning af mikroorganismer34, klassificering af bakteriel slægten35 , 36, hurtig og etiket-fri påvisning af miltbrand sporer37, automatiseret analyse af sædceller38, analyse af kræft celler39,40, og påvisning af makrofag aktivering41.

Denne protokol giver detaljerede trin for at udføre etiket-fri identifikation af lymfocyt typer på den enkelte celle niveau ved hjælp af 3D QPI og machine learning. Dette omfatter: 1) lymfocyt isolation fra mus blod, 2) lymfocyt sortering via flow flowcytometri, 3) 3D QPI, 4) kvantitative funktion udvinding fra 3D RI Tomogrammer og 5) overvåget læring til at identificere lymfocyt typer.

Protocol

Dyrs pleje og eksperimentelle procedurer blev udført under godkendelse af institutionelle dyrs pleje og brug Udvalget af KAIST (KA2010-21, KA2014-01 og KA2015-03). Alle eksperimenter i denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer. 1. lymfocytter Isolation fra mus blod Når en C57BL/6J mus er euthanized via CO2 indånding, indsætte en 26 G kanyle ind i musen hjertet og indsamle 0,3 mL blod. Direkte sætte blod ind i et rør med 1…

Representative Results

Figur 1 viser skematisk processen med den hele protokol. Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her, vi isoleret B (n = 149), CD4 + T (n = 95), og CD8 + T (n = 112) lymfocytter. For at få oplysninger om hovedaktivitet og amplitude på forskellige vinkler af belysning, blev flere 2D hologrammer af hver lymfocyt målt ved at ændre vinklen af belysning (fra-60 ° til 60 °). Typisk 50 hologrammer kan bruges til at rekonstruere en 3D RI tomogram, men…

Discussion

Vi præsenterer en protokol, der gør det muligt for etiket-fri identifikation af lymfocyt typer at udnytte 3D kvantitative fase imaging og machine learning. Kritiske trin i denne protokol er kvantitative fase imaging og funktion udvalg. For den optimale holografisk imaging, bør tætheden af celler kontrolleres som beskrevet ovenfor. Mekanisk stabilitet af cellerne er også vigtigt at få en præcis 3D RI distribution, fordi flydende eller vibrationelle cellulære beslutningsforslag vil forstyrre hologram målinger på …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af KAIST BK21 + Program, Tomocube, Inc., og National Research Foundation Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo anerkender støtte fra KAIST Presidential Fellowship og Asan Foundation biomedicinsk videnskab legat.

Materials

Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503 (2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14 (2010).
  3. Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (16), 6776-6781 (2007).
  4. Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105 (7), 2828-2835 (2005).
  5. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
  6. Popescu, G. . Quantitative phase imaging of cells and tissues. , (2011).
  7. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  8. Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. , 106328 (2017).
  9. Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2 (2), (2016).
  10. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1 (4), 153-156 (1969).
  11. Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046009 (2014).
  12. Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8 (3), 256 (2014).
  13. Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4 (4), 460-463 (2017).
  14. Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
  15. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
  17. Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
  18. Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
  19. Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
  20. Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6 (6), 20869 (2011).
  21. Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3865-3875 (2015).
  22. Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
  23. Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. , (2017).
  24. Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  25. Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  26. Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson’s disease. Cytometry Part A. 91 (5), 510-518 (2017).
  27. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
  28. Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8 (1), 210 (2017).
  29. Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
  30. Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. , (2016).
  31. Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (9), 7908-7917 (2017).
  32. Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  33. Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. , (2018).
  34. Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13 (12), 4492-4506 (2005).
  35. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23 (12), 15792-15805 (2015).
  36. Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
  37. Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3 (8), 1700606 (2017).
  38. Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91 (9), 893-900 (2017).
  39. Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91 (5), 482-493 (2017).
  40. Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. , (2017).
  41. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  42. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  43. Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72 (1), 156-160 (1982).
  44. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36 (23), 4677-4679 (2011).
  45. Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011005 (2013).
  46. Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15 (4), 1123-1132 (2015).
  47. Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8 (12), 5688-5697 (2017).
  48. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. , (2018).
  49. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (5), 2496-2518 (2017).

Tags

Label-freeLymphocyte Subtypes3D Quantitative Phase ImagingMachine LearningFluorescence LabelingFlow CytometryRefractive Index TomographyBlood CancerAutoimmune DiseaseSingle-cell AnalysisBacteria3D Quantitative Phase MicroscopeRPMI MediumDigital Micromirror Device3D Reconstruction
check_url/fr/58305?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image