Isolamento delle vescicole extracellulari dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino usando una tecnica di centrifugazione di ultrafiltrazione
Summary
Qui, descriviamo due protocolli di isolamento delle vescicole extracellulari, centrifugazione di ultrafiltrazione e ultracentrifugazione con centrifugazione su gradiente densità, per isolare le vescicole extracellulari da campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare murino. Le vescicole extracellulari derivate dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino con entrambi i metodi sono quantificate e caratterizzate.
Abstract
Vescicole extracellulari (EVs) sono recentemente scoperti componenti sottocellulari che svolgono i ruoli importanti in molti biologico le funzioni di segnalazione durante gli stati fisiologici e patologici. L’isolamento del SVE continua ad essere una grande sfida in questo campo, a causa delle limitazioni intrinseche di ogni tecnica. L’ultracentrifugazione differenziale con metodo di centrifugazione su gradiente di densità è un approccio comunemente utilizzato ed è considerato come la procedura di gold standard per l’isolamento di EV. Tuttavia, questa procedura è che richiede tempo, lavoro ad alta intensità e provoca generalmente bassa scalabilità, che potrebbe non essere adatto per piccoli volumi di campioni come fluido di lavaggio broncoalveolare. Dimostriamo che un metodo di isolamento di centrifugazione di ultrafiltrazione è semplice ed efficiente in tempo e lavoro ancora fornisce un recupero ad alta resa e purezza. Proponiamo che questo metodo di isolamento potrebbe essere un metodo alternativo che è adatto per l’isolamento di EV, specialmente per piccoli volumi di campioni biologici.
Introduction
Gli esosomi sono il più piccolo sottoinsieme di EVs, 50 – 200 nanometro di diametro ed hanno funzioni biologiche attraverso una gamma diversificata di segnalazione processi1,2,3,4,5. Regolano l’omeostasi cellulare e tissutale soprattutto facilitando la comunicazione intercellulare attraverso molecole di carico quali lipidi, proteine e acidi nucleici6,7,8,9 . Un passo fondamentale nella ricerca di EV è il processo di isolamento. Ultracentrifugazione differenziale (UC), con o senza centrifugazione in gradiente di densità (DGC), è considerato l’approccio di gold standard, ma questo metodo comporta limitazioni principali, compresi tassi di recupero EV inefficienti e scalabilità basso10 , 11 , 12, che limitano il suo utilizzo migliore ai più grandi campioni di volume, come gli esemplari della produzione esosomi surnatante o alta coltura cellulare. I vantaggi e gli svantaggi di altri metodi, come l’esclusione di dimensione di ultrafiltrazione o cromatografia di immunoaffinità isolamento da perline o colonne e microfluidica, sono ben descritti e moderne procedure aggiuntive sono state sviluppate per superare e ridurre al minimo le limitazioni tecniche in ogni approccio11,12,13,14,15. Altri hanno indicato che una centrifugazione di ultrafiltrazione (UFC) con una membrana nanoporosa nell’unità filtro è una tecnica alternativa che fornisce purezza paragonabile a un UC metodo16,17,18. Questa tecnica potrebbe essere considerata come uno dei metodi alternativi di isolamento.
Fluido di lavaggio broncoalveolare (BALF) contiene SVE che possiedono numerose funzioni biologiche in varie circostanze respiratorie19,20,21,22. Lo Studio SVE BALF derivato comporta alcune sfide a causa dell’invasività della procedura broncoscopia in esseri umani, così come una quantità limitata di recupero liquido di lavaggio. In piccoli animali da laboratorio come topi, solo pochi millilitri possono essere recuperati in condizioni normali del polmone, anche meno in polmoni infiammati o fibrotica23. Di conseguenza, raccogliendo una quantità sufficiente di BALF per EV isolamento da un ultracentrifugazione differenziale per applicazioni a valle potrebbe non essere fattibile. Tuttavia, isolando corretta EV popolazioni è un fattore cruciale per lo studio delle funzioni biologiche EV. Il delicato equilibrio tra efficienza ed efficacia continua ad essere una sfida in metodi di isolamento EV ben stabiliti.
In questo studio, dimostriamo che un approccio di ultrafiltrazione centrifugo, utilizzando un’unità di filtro nanomembrana 100 kDa peso molecolare cut-off (MWCO), è adatto per piccoli volumi di campioni biologici quali BALF. Questa tecnica è semplice, efficiente e fornisce ad alta purezza e scalabilità per supportare lo studio di BALF derivato EVs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli ultimi decenni, gli scienziati hanno dipanato i significati del SVE in omeostasi cellulare. Ancora più importante, EVs svolgono un ruolo importante in molti processi di malattia modulando le celle vicine e lontane a loro carico bioattivi molecole1,21,22,26,27 , 28 , 29 , <s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è supportato da sovvenzioni NHLBI/NIH HL103868 (a P.C.) e HL137076 (a P.C.), la sovvenzione di associazione cuore americano (a P.C.) e Samuel Oschin completa Cancer Institute (SOCCI) Lung Cancer Research Award (a P.C.). Vorremmo esprimere il nostro grande apprezzamento per l’Istituto del cuore di Smidt al Cedars-Sinai Medical Center che ci fornisce una macchina Nanosight per EV nanoparticle tracking analysis.
Materials
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | – | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | – | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | – | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | – | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | – | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
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