Isolement des vésicules extracellulaires du murin lavage broncho-alvéolaire fluide à l’aide d’une Technique de Centrifugation de l’Ultrafiltration

Résumé

Nous décrivons ici les deux protocoles d’isolement vésicule extracellulaire, centrifugation d’ultrafiltration et ultracentrifugation avec centrifugation en gradient de densité, d’isoler des vésicules extracellulaires des échantillons de liquide de lavage broncho-alvéolaire murine. Les vésicules extracellulaires dérivés du murin de lavage bronchoalvéolaire par ces deux méthodes sont quantifiés et caractérisés.

Résumé

Vésicules extracellulaires (EVs) sont des composants subcellulaires nouvellement découverts qui jouent un rôle important dans de nombreux biologique des fonctions de signalisation lors d’États physiologiques et pathologiques. L’isolement du SVE demeure un défi majeur dans ce domaine, en raison des limites inhérentes à chaque technique. L’ultracentrifugation différentielle avec la méthode de centrifugation en gradient de densité est une approche couramment utilisée et est considérée comme la procédure de l’étalon-or pour l’isolement de l’EV. Toutefois, cette procédure est longue et fastidieuse et donne généralement lieu à faible évolutivité, qui peut ne pas convenir pour les petits échantillons comme liquide de lavage broncho-alvéolaire. Nous démontrons qu’une méthode d’isolement de centrifugation ultrafiltration est simple et efficace-temps et travail encore fournit un rendement élevé de récupération et la pureté. Nous proposons que cette méthode d’isolement pourrait être une approche alternative qui convient pour l’isolation de l’EV, particulièrement pour les petits spécimens biologiques.

Introduction

Exosomes sont le plus petit sous-ensemble du SVE, 50 à 200 nm de diamètre et ont plusieurs fonctions biologiques à travers un large éventail de processus^1,2,3,4,5de signalisation. Elles régissent l’homéostasie cellulaire et tissulaire principalement en facilitant la communication intercellulaire par l’intermédiaire de molécules de fret comme les lipides, les protéines et acides nucléiques^6,7,8,

Protocole

L’utilisation des animaux et toutes les procédures d’animaux ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation comités (IACUC) au Cedars-Sinai Medical Center (CSMC).

1. préparation et collecte de fluide (LLBA) murin lavage broncho-alvéolaire

1. Collection de BALF
   1. Euthanasier la souris avec un cocktail de kétamine (300 mg/kg) et de xylazine (30 mg/kg) par voie intrapéritonéale suivie par dislocation cervicale.
   2. Insérer un cathéter 22 G dans la trachée. Fixez une seringue à insuline contenant 1 mL (mL) de solution saline tampon phosphate de Dulbecco stérile glacé (SPD) et instiller 1 mL du SPD dans les ....

Résultats

Nous avons réalisé isolement EV de souris BALF à l’aide de méthodes d’isolation UFC et UC-GCR le jour même. La méthode UFC exigeait environ 2,5 à 3 h, tandis que la technique de l’UC-DGC requis 8 h de temps de traitement. Cela ne comprenait pas les tampons et les temps de préparation de réactif. Il est à noter que certaines autres tâches peuvent être effectuées durant les périodes longues de centrifugation. Néanmoins, l’ensemble de la procédure a duré presque une journée entière pour la t.......

Discussion

Dans les dernières décennies, les scientifiques ont démêlé les significations du SVE dans l’homéostasie cellulaire. Plus important encore, les EVs jouent un rôle important dans de nombreux processus de maladie en modulant les cellules voisines et lointaines à leur cargaison bioactifs molécules^{1,21,22,26,27 , 28 ,} <.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Material
Amicon Ultra-15 Ultracel-100K	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	UFC910024
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Corning Cellgro, Manassas, VA	21-031-CV
Saccharose	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	EMD8550
HEPES	Research Products International, Prospect, IL	75277-39-3
EDTA	Corning Cellgro, Manassas, VA	46-034-CI
Chlorure de sodium	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	S3014-1KG
OptiPrep	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	MKCD9753	Gradient de densité moyen
Kétamine	VetOne, Boise, ID	13985-702-10
Xylazine	Akorn Animal Health, Lake Forest, IL	59399-110-20
Seringue 1 mL	Seringue BD, Franklin Lakes, NJ	309656
Angiocatheter 20 G	BD Seringue, Franklin Lakes, NJ	381703
Tubes à centrifuger 15 mL	VWR, Radnor, PA	89039-666
Tubes à centrifuger 50 mL	Corning Cellgro, Manassas, VA	430828
Test de la protéine d’acide bicchonique (BCA)	Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL	23235
Anticorps anti-souris TSG101 de lapin	AbCam, Cambridge, MA	AB125011
Anticorps anti-souris PE-CD63 de rat	Biolegend, San Diego, CA	143904
CD81
CD9
IgG anti-lapin, anticorps liés à HRP	Technologie de signalisation cellulaire, Danvers, MA	7074S
4x LDS
10x Agent réducteur (Bolt)
10x Tampon de lyse (Bolt)	Technologie de signalisation cellulaire, Danvers, MA
Bolt 4-12 % Bis-Tris Plus acrylamide	gel Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	NW04120
iBlot 2 Mini piles de nitrocellulose	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	IB23002
Réactif chimiluminescent de détection d’anticorps HRP HyGLO	Denville Scientific, Holliston, MA	E2400
Tubes ultracentrifuges 17 mL	Beckman Coulter, Pasadena, CA	337986
Tubes ultracentrifuges 38,5 mL	Beckman Coulter, Pasadena, CA	326823
Corning SFCA Filtres pour seringues 0.2 & micro ; m pore	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	09-754-13
Equipment
Centrifugeuse	Eppendorf, Hambourg,	Allemagne-Ultracentrifugeuse
	Beckman Coulter, Pasadena, CA-Nanosight
(NS300)	Malvern, Worcestershire,	UK-Pour	mesurer la distribution granulométrique et concentration de particules
MACSQuant Analyzer 10 cytomètre en flux	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,	Allemagne-iBlot
Appareil de transfert		Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad
ChemiDoc MP Imaging System	Bio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10			Logiciel d’analyse

Filtres centrifuges