عزل حويصلات خارج الخلية من السوائل مورين للفيسيولوجيا الغسل باستخدام أسلوب الطرد المركزي أولترافيلتريشن
Summary
هنا، نحن تصف البروتوكولين من العزلة حويصلة خارج الخلية، أولترافيلتريشن الطرد المركزي وتنبيذ فائق مع كثافة التدرج الطرد المركزي، لعزل حويصلات خارج الخلية من الغسل للفيسيولوجيا مورين عينات السوائل. الحويصلات خارج الخلية المستمدة من سائل الغسل للفيسيولوجيا مورين بكلتا الطريقتين كمياً وتتميز.
Abstract
حويصلات خارج الخلية (EVs) هي مكونات سوبسيلولار المكتشفة حديثا التي تلعب أدواراً هامة في البيولوجية العديد من الإشارات وظائف خلال الدول الفسيولوجية والمرضية. عزل المركبات الكهربائية لا يزال يشكل تحديا رئيسيا في هذا المجال، بسبب القيود المتأصلة لكل تقنية. هو نهج استخداماً تنبيذ فائق التفاضلية مع أسلوب الطرد المركزي التدرج الكثافة ويعتبر الإجراء معيار الذهب لعزل EV. بيد أن هذا الإجراء هو مضيعة للوقت، وكثيفة العمالة، ويؤدي عادة في قابلية منخفضة، التي قد لا تكون مناسبة لعينات صغيرة الحجم مثل سائل الغسل للفيسيولوجيا. ونحن تبين أن أسلوب عزل الطرد المركزي أولترافيلتريشن بسيطة وفعالة من حيث الوقت والعمل يوفر الانتعاش عالية الغلة والنقاء. ونحن نقترح أن هذا الأسلوب العزلة يمكن أن يكون نهج بديل مناسب لعزل EV، خاصة بالنسبة للعينات البيولوجية صغيرة الحجم.
Introduction
اكسوسوميس هي مجموعة فرعية أصغر من المركبات الكهربائية، 50 – 200 نانومتر في القطر، ولها وظائف متعددة والبيولوجية عبر مجموعة متنوعة من إشارات العمليات1،2،3،،من45. أنها تنظم الخلايا والأنسجة والتوازن أساسا بتيسير الاتصالات بين الخلايا عن طريق جزيئات البضائع مثل الدهون والبروتينات، والأحماض النووية6،،من78،9 . واحد خطوة حاسمة في البحث EV هو عملية العزل. التفضيلية تنبيذ فائق (UC), مع أو بدون كثافة التدرج الطرد المركزي (DGC)، يعتبر النهج معيار الذهب، ولكن هذا الأسلوب يحمل القيود الرئيسية، بما في ذلك عدم كفاية معدلات الاسترداد EV وقابلية منخفضة10 , 11 , 12، التي تقيد استخدامها أفضل إلى أكبر حجم العينات، مثل خلية ثقافة اكسوسومي طافية أو ارتفاع إنتاج العينات. مزايا وعيوب الأساليب الأخرى، مثل حجم الاستبعاد ultrafiltration أو اللوني، عزل إيمونوافينيتي بواسطة الخرز أو الأعمدة، وميكروفلويديكس، موصوفة جيدا، ووضعت إجراءات تكميلية الحديثة إلى التغلب عليها، وتقليل القيود التقنية في كل نهج12،،من1113،،من1415. البعض الآخر قد أظهرت أن أولترافيلتريشن الطرد المركزي (الوليد) بغشاء نانوبوروس في وحدة التصفية وهي تقنية بديلة يوفر النقاء مقارنة بتفرد أسلوب16،،من1718. يمكن اعتبار هذا الأسلوب أحد الأساليب البديلة العزلة.
للفيسيولوجيا الغسل السائل (بالف) تحتوي على المركبات الكهربائية التي تمتلك العديد من الوظائف البيولوجية في مختلف ظروف الجهاز التنفسي19،،20،21،22. دراسة يستتبع المركبات الكهربائية المستمدة من بالف بعض التحديات بسبب اختزاع الإجراء القصبات في البشر، فضلا عن كمية محدودة من استعادة السوائل الغسل. في الحيوانات المختبرية الصغيرة مثل الفئران، ملليلتر قليلة فقط يمكن استردادها في الظروف العادية الرئة، وحتى أقل من ذلك في الرئتين ملتهبة أو تليفية23. وبالتالي فإن جمع كمية كافية من بالف لعزل EV تنبيذ فائق تفاضلية للتطبيقات المتلقين للمعلومات قد لا يكون ممكناً. ومع ذلك، عزل السكان EV الصحيح عاملاً حاسما لدراسة الوظائف البيولوجية EV. التوازن الدقيق بين الكفاءة والفعالية لا يزال يشكل تحديا في أساليب العزلة EV الراسخة.
في هذه الدراسة الحالية، ونحن تبين أن نهج ultrafiltration الطرد مركزي، استخدام كاتشين 100 وزن الجزيئي وقف إنتاج المواد الانشطارية (موكو) نانوميمبراني تصفية وحدة، مناسبة للعينة البيولوجية صغيرة الحجم مثل بالف. هذا الأسلوب هو بسيط وفعال، ويوفر درجة نقاء عالية وقابلية لدعم دراسة المركبات الكهربائية المستمدة من بالف.
Protocol
Representative Results
Discussion
في العقود القليلة الماضية، وقد متدهور العلماء دلالات من المركبات الكهربائية في التوازن الخلوية. الأهم من ذلك، تؤدي المركبات الكهربائية أدواراً رئيسية في العديد من الأمراض العمليات بتحوير الخلايا المجاورة والبعيدة من خلال تلك الشحنات النشطة بيولوجيا الجزيئات1،<sup class="…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
العمل معتمد من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة/NHLBI HL103868 (للكمبيوتر) و HL137076 (على الكمبيوتر)، ومعونات جمعية القلب الأمريكية (للكمبيوتر) وجائزة البحث معهد السرطان الشامل صامويل أوشين (سوتشي) سرطان الرئة (للكمبيوتر). ونود أن نعرب عن تقديرنا الكبير لمعهد القلب سميت في سيدرز-سيناء الطبي أن يوفر لنا آلة Nanosight نانوحبيبات EV تتبع تحليل.
Materials
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | – | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | – | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | – | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | – | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | – | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
References
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
- Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
- Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
- Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
- Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
- Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).
- Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Recherche en cancérologie. 77 (9), 2306-2317 (2017).
- Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
- Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
- Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
- Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).
- Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277 (2016).
- Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
- Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS – Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
- Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).
- Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).
