एक Ultrafiltration केंद्रापसारक तकनीक का उपयोग Murine Bronchoalveolar लेवेज द्रव से Extracellular बुलबुले के अलगाव
Summary
यहां, हम दो extracellular पुटिका अलगाव प्रोटोकॉल, ultrafiltration केंद्रापसारक और घनत्व ढाल केंद्रापसारक के साथ ultracentrifugation, extracellular murine bronchoalveolar द्रव के नमूनों से लेवेज बुलबुले अलग वर्णन । दोनों तरीकों से murine bronchoalveolar लेवेज द्रव से व्युत्पंन extracellular बुलबुले quantified और विशेषता हैं ।
Abstract
Extracellular बुलबुले (ईवीएस) नए शारीरिक और रोग राज्यों के दौरान कई जैविक संकेतन कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभा है कि सेलुलर घटकों की खोज कर रहे हैं । ईवीएस के अलगाव के लिए इस क्षेत्र में एक बड़ी चुनौती है, प्रत्येक तकनीक को आंतरिक सीमाओं के कारण जारी है । घनत्व ढाल केंद्रापसारक विधि के साथ अंतर ultracentrifugation एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण है और EV अलगाव के लिए सोने के मानक प्रक्रिया माना जाता है । हालांकि, इस प्रक्रिया को समय लेने वाली, श्रम गहन है, और आम तौर पर कम दरिद्रता में परिणाम है, जो bronchoalveolar लेवेज द्रव जैसे छोटे मात्रा के नमूनों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है । हम प्रदर्शित करते है कि एक ultrafiltration केंद्रापसारक अलगाव विधि सरल और समय है और श्रम कुशल अभी तक एक उच्च वसूली उपज और पवित्रता प्रदान करता है । हम प्रस्ताव है कि इस अलगाव विधि एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि EV अलगाव के लिए उपयुक्त है, विशेष रूप से छोटी मात्रा के जैविक नमूनों के लिए हो सकता है ।
Introduction
Exosomes व्यास में ईवीएस, 50-200 एनएम के सबसे छोटे सबसेट हैं, और प्रक्रियाओं1,2,3,4,5संकेतन की एक विविध सरणी भर में कई जैविक कार्य किया है । वे लिपिड, प्रोटीन, और न्यूक्लिक एसिड6,7,8,9 जैसे कार्गो अणुओं के माध्यम से सेलुलर संचार की सुविधा के द्वारा मुख्य रूप से सेलुलर और ऊतक homeostasis को नियंत्रित . एक EV अनुसंधान में महत्वपूर्ण कदम अलगाव की प्रक्रिया है । अंतर ultracentrifugation (यूसी), के साथ या बिना घनत्व ढाल केंद्रापसारक (क्लब), सोने के मानक दृष्टिकोण माना जाता है, लेकिन इस विधि अकुशल EV वसूली दरों और कम दरिद्रता सहित प्रमुख सीमाओं वहन करती है10 , 11 , 12, कि इस तरह के सेल संस्कृति supernatant या उच्च exosome उत्पादन नमूनों के रूप में बड़ी मात्रा के नमूनों के लिए अपने सबसे अच्छा उपयोग को प्रतिबंधित । ऐसे ultrafiltration या क्रोमैटोग्राफी द्वारा आकार अपवर्जन के रूप में अंय तरीकों के फायदे और नुकसान, मोतियों या स्तंभों द्वारा immunoaffinity अलगाव, और microfluidics, अच्छी तरह से वर्णित हैं, और आधुनिक पूरक प्रक्रियाओं को विकसित किया गया है पर काबू पाने और प्रत्येक दृष्टिकोण11,12,13,14,15में तकनीकी सीमाओं को कम । दूसरों को पता चला है कि फिल्टर इकाई में एक nanoporous झिल्ली के साथ एक ultrafiltration केंद्रापसारक (UFC) एक वैकल्पिक तकनीक है कि एक यूसी विधि16,17,18के लिए तुलनीय पवित्रता प्रदान करता है । इस तकनीक को वैकल्पिक आइसोलेशन विधियों में से एक माना जा सकता है ।
Bronchoalveolar लेवेज द्रव (BALF) ईवीएस है कि विभिंन श्वसन शर्तों19,20,21,22में कई जैविक कार्यों के अधिकारी शामिल हैं । BALF का अध्ययन-व्युत्पंन ईवीएस मनुष्यों में ब्रोंकोस्कोपी प्रक्रिया की इनवेसिव के कारण कुछ चुनौतियों पर जोर देता है, साथ ही लेवेज द्रव वसूली की एक सीमित मात्रा में । चूहों जैसे छोटे प्रयोगशाला पशुओं में, केवल कुछ मिलीलीटर सामान्य फेफड़ों की स्थितियों में बरामद किया जा सकता, सूजन या fibrotic फेफड़ों में भी कम23. नतीजतन, बहाव अनुप्रयोगों के लिए एक अंतर ultracentrifugation द्वारा EV अलगाव के लिए BALF की एक पर्याप्त राशि का संग्रह संभव नहीं हो सकता है । हालांकि, अलग सही ev आबादी ev जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है । कार्यकुशलता और प्रभावकारिता के बीच नाजुक संतुलन अच्छी तरह से स्थापित EV आइसोलेशन तरीकों में एक चुनौती है ।
इस वर्तमान अध्ययन में, हम प्रदर्शित करते है कि एक केंद्रापसारक ultrafiltration दृष्टिकोण, एक १०० केडीए आणविक वजन कट ऑफ (MWCO) nanomembrane फिल्टर इकाई का उपयोग, छोटी मात्रा जैविक नमूना जैसे BALF के लिए उपयुक्त है । इस तकनीक को सरल, कुशल है, और उच्च शुद्धता और दरिद्रता प्रदान करता है BALF-व्युत्पंन ईवीएस के अध्ययन का समर्थन है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
पिछले कुछ दशकों में, वैज्ञानिकों ने सेलुलर homeostasis में ईवीएस की महत्ता को सुलझा लिया है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, ईवीएस अपने सक्रिय कार्गो अणुओं के माध्यम से पड़ोसी और दूर कोशिकाओं को मॉडुलन द्वारा कई रोग ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
काम NHLBI/NIH अनुदान HL103868 द्वारा समर्थित है (पीसी के लिए) और HL137076 (पीसी के लिए), अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान में सहायता (पीसी के लिए), और शमूएल Oschin व्यापक कैंसर संस्थान (SOCCI) फेफड़ों के कैंसर अनुसंधान पुरस्कार (पीसी के लिए) । हम देवदारों-सिनाई मेडिकल सेंटर में Smidt हार्ट इंस्टीट्यूट के लिए हमारी महान सराहना व्यक्त करना चाहते है जो हमें EV nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए एक Nanosight मशीन प्रदान करता है ।
Materials
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | – | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | – | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | – | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | – | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | – | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
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