Detektion og isolering af apoptotiske organer til høj renhed
Summary
En arbejdsproces ved hjælp af flow flowcytometri eller differentiale centrifugering er udviklet til at registrere, kvantificere og isolere apoptotiske organer fra en apoptotiske prøve til høj renhed.
Abstract
Apoptotiske organer (ApoBDs), microvesicles og exosomes er de vigtigste medlemmer af familien ekstracellulære vesikel, med ApoBDs at være en af de største type. Det er blevet foreslået, at ApoBDs kan støtte celle clearance samt intercellulær kommunikation gennem menneskehandel biomolekyler. Konventionelle metoder anvendes til identifikation og dyrkning af ApoBDs er ofte begrænset af manglen på nøjagtig kvantificering og lave prøve renhed. Her beskriver vi en arbejdsgang for at bekræfte induktion af apoptose, validere ApoBD dannelse og isolere ApoBDs til høj renhed. Vi vil også redegøre for og sammenligne fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) og differentieret centrifugering baserede tilgange til at isolere ApoBDs. Derudover renheden af isolerede ApoBDs vil blive bekræftet ved hjælp af en tidligere etablere flow flowcytometri-baserede farvning og analysemetode. Taget sammen, ved hjælp af metoden beskrevet THP-1 monocyt apoptose og apoptotiske celle demontering blev induceret og valideret, og ApoBD genereres fra THP-1 monocytter blev isoleret til en renhed på 97-99%.
Introduction
Apoptose, et godt undersøgt form af programmeret celledød, er forpligtet til at opretholde fysiologiske homeostase og fjerne potentielt skadelige celler i den menneskelige krop1. Efter induktion af apoptose, kan apoptotiske celler (ApoCells) underkastes en række morfologiske ændringer og adskille i lille membran-bundet vesikler betegnes ApoBDs. Samlet set denne proces er kendt som apoptotiske celle demontering og kan opdeles i 3 særskilte foranstaltninger baseret på morfologi2,3. Trin 1 (plasma membran blebbing) er karakteriseret ved dannelsen af ballon-lignende strukturer på cellens overflade kaldes blebs4,5. Trin 2 (apoptotiske fremspring dannelse) omfatter dannelsen af lange membran fremspring såsom apoptopodia, beaded apoptopodia og mikrotubulus pigge6,7,8. Endelig, trin 3 (ApoBD dannelse) omfatter fragmentering af de apoptotiske fremspring og/eller ApoCells til at generere ApoBDs6,9. Tidligere resultater har foreslået en rolle for ApoBDs i medvirken apoptotiske celle clearance og mægle intercellulær kommunikation. For eksempel foreslås det, at fragmenteringen af en ApoCell i ApoBDs kan generere små ‘bite-sized’ stykker, der let kunne fjernes ved at omgive fagocytter2,10,11. Derudover kan ApoBDs havnen en serie af biomolekyler DNA, RNA og proteiner, som kan være smugles til omkringliggende celler til at lette celle-celle kommunikation12,13,14. Til funktionelt undersøge disse processer, er det afgørende at bekræfte tre nøgleparametre, herunder a validering af apoptose induktion og ApoBD dannelse, (ii) isolation af ApoBDs, og (iii) bekræftelse af ApoBD renhed.
Tidligere har været brugt en række metoder, herunder flowcytometri og elektronmikroskopi at studere apoptose og ApoBDs15,16,17,18. ApoBD påvisning og kvantificering er dog ofte vanskelig eller overset. For eksempel, mest rutinemæssigt anvendes flow flowcytometri-baserede apoptose assay beskæftiger annexin V (A5, et protein, der binder de externalized ‘ spise-mig ‘ signal Phosphatidylserin (PtdSer)) og nukleinsyre pletten propidium Iodid (PI)19. Men ved hjælp af denne universelle pletten kombination, analyse forudsætter, at der er kun tre typer af celle subsets (levedygtige celler, ApoCells og nekrotiske celler) i prøven. Desuden, selvom betragtes som “guld standard” af mange forskere for apoptose, flowcytometri undersøgelser og efterfølgende dataanalyse udelukker ofte ApoBDs gennem en indledende gating skridt at vælge FSC/SSCintermediate-høj begivenheder. Derfor, vi har for nylig udviklet en roman flow flowcytometri assay bruger A5 og til-PRO-3, en anden nukleinsyre plet, der selektivt kan tages op af caspase 3/7-aktiveret pannexin 1 (PANX1) kanaler7,20. Som caspase 3-induceret PANX1 aktivering forud PtdSer eksponering på det tidlige stadium af apoptose, pletter til-PRO-3 varierende apoptotiske og nekrotiske celler. Denne indfaldsvinkel kombineret med vores roman, gating strategi indeholder desuden alle erhvervede begivenheder under dataanalyse og som følge heraf seks celle/partikel delmængder er identificeret, herunder: (i) levedygtige celler (FSC/SSCmellemliggende/høj, A5lav , Til-PRO-3lav), (ii) A5– tidlig ApoCells (FSC/SSCmellemliggende/høj, A5lav, til-PRO-3mellemliggende), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCmellemliggende/høj, A5høj , Til-PRO-3mellemliggende), (iv) nekrotiske celler eller sene ApoCells (FSC/SSCmellemliggende/høj, A5højt, til-PRO-3høje), (v) ApoBDs (FSC/SSClav, A5mellemliggende, til-PRO-3lav / mellemliggende), og (vi) vragrester (FSC/SSClav, A5lav, til-PRO-3lav)20. Vores tilgang understreger vigtigheden af at analysere alle celler/partikel delmængder og endnu vigtigere, adskillelsen af ApoBDs fra celler og debris20. Således, denne tilgang viser en effektiv teknik for at validere induktion af apoptose og ApoBD dannelse samtidigt.
ApoBDs har traditionelt været isoleret gennem en række differentierede centrifugering tilgange hvorved ApoBDs kan adskilles fra celler eller andre ekstracellulære vesikler baseret på tæthed. Men sådanne centrifugering metoder er ofte begrænset af lav ApoBD renhed, manglen på en kvantificering trin at bekræfte prøve renhed, og/eller manglende evne til at adskille celle typespecifikke ApoBDs17,21,22. Derfor, vi for nylig udviklet to tilgange, en FACS-baseret og en ny differentieret centrifugering-baseret tilgang, som kan kobles til vores tidligere etablerede flow flowcytometri metode til validering af induktion af apoptose og prøve renhed23. ApoBD isolation via vores FACS-baserede tilgang kan berige ApoBDs til op til 99% renhed, og kan være kombineret med en bred vifte af celle type-specifikke antistoffer til at isolere ApoBDs fra blandet cellepopulationer, vævsprøver og kropsvæsker23. Desuden vores reviderede differential centrifugering tilgang viser en effektiv metode til at isolere ApoBDs til > 90% renhed23.
I dette papir beskriver vi i detaljer vores forsøgsmetoden at validere apoptose induktion, og for at påvise og bestemme ApoBD dannelse. ApoBD isolation arbejdsprocesser ved hjælp af FACS-baseret og differentieret centrifugering-baserede metoder er også udarbejdet og sammenlignet. De repræsentative data viser, at den beskrevne metode giver en effektiv banebrydende værktøj til fremtidige ApoBD undersøgelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Siden sin tidlige beskrivelse i 1950 ‘ erne, har feltet af apoptose avancerede markant, at blive en fremtrædende forskningsområde. På trods af bred interesse og omfattende indsats, visse aspekter af apoptose, især dannelsen af ApoBDs, ikke er blevet godt undersøgt på grund af manglende egnede metoder. Disse vil navnlig omfatte begrænsning i sporing apoptose progression og ApoBD dannelse samtidigt ved hjælp af den traditionelle flowcytometri A5/PI analyse og urenheder i ApoBD isolation. Vi har for nylig udviklet m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det fungerede blev støttet af tilskud fra National sundhed og Medical Research Council (GNT1125033 og GNT1140187) og australske Forskningsråd (DP170103790) til I.K.H.P.
Materials
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | – | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | – | – | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | – | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | – | – | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | – | |
| FlowJo 8.8.6 software | – | – | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | – |
References
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
- Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
- Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
- Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
- Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439 (2015).
- Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
- Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
- Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
- Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
- Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81 (2009).
- Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
- Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
- Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
- Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
- Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846 (2017).
- Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444 (2017).
