उच्च शुद्धता के लिए अपोप्तोटिक निकायों का पता लगाना और अलगाव
Summary
प्रवाह cytometry या विभेदक केंद्रापसारक का उपयोग कर एक कार्यप्रवाह उच्च शुद्धता के लिए एक अपोप्तोटिक नमूना से अपोप्तोटिक निकायों का पता लगाने, यों और अलग करने के लिए विकसित की है ।
Abstract
अपोप्तोटिक निकायों (ApoBDs), microvesicles और exosomes extracellular पुटिका परिवार के प्रमुख सदस्य हैं, ApoBDs सबसे बड़ा प्रकार में से एक होने के साथ । यह प्रस्ताव किया गया है कि ApoBDs सेल क्लीयरेंस के साथ-साथ सेलुलर संचार के माध्यम से भी तस्करी के अणुओं को सहायता कर सकते हैं । पारंपरिक पहचान और ApoBDs के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण अक्सर सही ठहराव और कम नमूना शुद्धता की कमी से सीमित हैं । यहाँ, हम apoptosis की प्रेरण की पुष्टि करने के लिए एक कार्यप्रवाह का वर्णन, ApoBD गठन मान्य है, और उच्च शुद्धता के लिए ApoBDs को अलग. हम भी रूपरेखा और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) और विभेदक केंद्रापसारक आधारित दृष्टिकोण ApoBDs को अलग करने के लिए तुलना करेंगे । इसके अलावा, पृथक ApoBDs की पवित्रता की पुष्टि की जाएगी एक पहले से स्थापित प्रवाह cytometry आधारित धुंधला और विश्लेषणात्मक विधि का उपयोग कर । एक साथ ले लिया, वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग कर, THP-1 monocyte apoptosis और अपोप्तोटिक कोशिका विधानसभा प्रेरित और मान्य किया गया था, और ApoBD से उत्पन्न-1 THP 97-99% की शुद्धता के लिए अलग-थलग थे.
Introduction
Apoptosis, क्रमादेशित कोशिका मृत्यु का एक अच्छी तरह से अध्ययन फार्म, शारीरिक homeostasis बनाए रखने और मानव शरीर के भीतर संभावित हानिकारक कोशिकाओं को हटाने के लिए आवश्यक है1. apoptosis की प्रेरण के बाद, अपोप्तोटिक कोशिकाओं (ApoCells) रूपात्मक परिवर्तन की एक श्रृंखला से गुजरना और छोटे झिल्ली में जुदा कर सकते हैं-बंधे बुलबुले ApoBDs । कुल मिलाकर, इस प्रक्रिया को अपोप्तोटिक सेल असेंबली के रूप में जाना जाता है और आकृति विज्ञान2,3के आधार पर 3 अलग चरणों में विभाजित किया जा सकता है । चरण 1 (प्लाज्मा झिल्ली blebbing) blebs4,5के रूप में जाना जाता सेल सतह पर गुब्बारे की तरह संरचनाओं के गठन की विशेषता है । चरण 2 (अपोप्तोटिक दखल गठन) apoptopodia, मनके-apoptopodia और microtubule spikes के रूप में लंबी झिल्ली की दखलंदाजी के गठन में शामिल6,7,8। अंत में, चरण 3 (ApoBD गठन) अपोप्तोटिक की दखलंदाजी और/या ApoCells6,9उत्पंन करने के लिए विखंडन भी शामिल है । पिछले निष्कर्षों अपोप्तोटिक सेल की मंजूरी और मध्यस्थता सेलुलर संचार सहायता में ApoBDs की भूमिका का सुझाव दिया है । उदाहरण के लिए, यह प्रस्तावित है कि ApoBDs में एक ApoCell के विखंडन ‘ छोटे काटने के आकार ‘ टुकड़े कि आसानी से फ़ैगोसाइट2,10,11आसपास के द्वारा हटाया जा सकता है उत्पंन कर सकते हैं । इसके अलावा, ApoBDs डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के रूप में इस तरह के अणुओं की एक श्रृंखला बंदरगाह हो सकता है, जो सेल सेल संचार की सुविधा के लिए आसपास के कोशिकाओं को तस्करी हो सकता है12,13,14. कार्यात्मक रूप से इन प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए, यह सहित तीन प्रमुख मापदंडों की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है (i) apoptosis प्रेरण और ApoBD गठन के सत्यापन, (ii) ApoBDs के अलगाव, और (iii) ApoBD शुद्धता की पुष्टि.
पहले, प्रवाह cytometry और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सहित कई तरीकों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है apoptosis और ApoBDs15,16,17,18. हालांकि, ApoBD डिटेक्शन और ठहराव अक्सर मुश्किल या अनदेखी कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, सबसे नियमित रूप से इस्तेमाल किया प्रवाह cytometry-आधारित apoptosis परख annexin V (A5, एक प्रोटीन है कि ‘ बाहरी ‘ खाने के बांध मुझे संकेत phosphatidylserine (PtdSer)) और न्यूक्लिक एसिड दाग propidium आयोडाइड (PI) को रोजगार19। हालांकि, इस सार्वभौमिक दाग संयोजन का उपयोग करके, विश्लेषण मानता है कि वहां केवल तीन प्रकार के सेल सबसेट (व्यवहार्य कोशिकाओं, ApoCells और गल कोशिकाओं) नमूने में हैं । इसके अलावा, हालांकि apoptosis, प्रवाह cytometry परख और अनुवर्ती डेटा विश्लेषण के लिए कई शोधकर्ताओं ने एक स्वर्ण मानक “के रूप में माना जाता है अक्सर FSC/एसएससीमध्यवर्ती-उच्च घटनाओं का चयन एक प्रारंभिक गेटिंग कदम के माध्यम से ApoBDs शामिल नहीं है । इसलिए, हम हाल ही में एक उपंयास प्रवाह cytometry परख A5 का उपयोग कर विकसित की है और प्रो-3, एक और न्यूक्लिक दाग है कि चुनिंदा caspase द्वारा लिया जा सकता है 3/7 सक्रिय pannexin 1 (PANX1) चैनल7,20। caspase 3-प्रेरित PANX1 सक्रियण के रूप में apoptosis के प्रारंभिक चरण में PtdSer जोखिम से पहले, करने के लिए-प्रो 3 विभेदक दाग अपोप्तोटिक और गल कोशिकाओं । इसके अलावा, हमारे उपंयास गेटिंग रणनीति के साथ संयुक्त इस दृष्टिकोण डेटा विश्लेषण के दौरान सभी अधिग्रहीत घटनाओं और एक परिणाम के रूप में शामिल हैं, छह सेल/कण सबसेट सहित, की पहचान कर रहे हैं: (i) व्यवहार्य कोशिकाओं (FSC/SSCमध्यवर्ती/उच्च, A5कम , टू-प्रो-3कम), (ii) a5– अर्ली ApoCells (FSC/sscइंटरमीडिएट/हाई, a5कम, टू-प्रो-3मध्यवर्ती), (iii) a5+ ApoCells (FSC/sscमध्यवर्ती/उच्च, a5उच्च , को-प्रो-3मध्यवर्ती), (iv) गल कोशिकाओं या देर से ApoCells (FSC/एसएससीइंटरमीडिएट/हाई,A5 हाई, टू-प्रो-3उच्च), (v) ApoBDs (FSC/एसएससीकम, A5मध्यवर्ती, टू-प्रो-3कम /intermediate), और (vi) मलबे (FSC/एसएससीकम, A5कम, टू-प्रो-3कम)20. हमारे दृष्टिकोण सभी कोशिकाओं का विश्लेषण के महत्व पर बल देता है/कण सबसेट और, अधिक महत्वपूर्ण बात, कोशिकाओं और मलबे से ApoBDs के जुदाई20। इस प्रकार, यह दृष्टिकोण एक कुशल तकनीक को प्रदर्शित करता है apoptosis और ApoBD गठन एक साथ की प्रेरण मांय है ।
परंपरागत रूप से, ApoBDs अंतर केंद्रापसारक दृष्टिकोण जिससे ApoBDs कोशिकाओं या अंय extracellular बुलबुले से अलग किया जा सकता है घनत्व के आधार पर विभिंन प्रकार के माध्यम से अलग किया गया है । हालांकि, इस तरह के केंद्रापसारक तरीकों अक्सर कम ApoBD शुद्धता, एक ठहराव कदम की कमी के लिए नमूना शुद्धता की पुष्टि के द्वारा सीमित हैं, और/या अलग सेल प्रकार-विशिष्ट ApoBDs17,21,22करने के लिए असमर्थता । इसलिए, हम हाल ही में दो दृष्टिकोण, एक FACS आधारित है और एक नया अवकलन केंद्रापसारक आधारित दृष्टिकोण है जो हमारे पहले की स्थापना की प्रवाह cytometry विधि के साथ युग्मित किया जा सकता है apoptosis और नमूना शुद्धता23की प्रेरण मांय के आधार पर विकसित की है । हमारे FACS आधारित दृष्टिकोण के माध्यम ApoBD अलगाव ९९% शुद्धता के लिए ApoBDs को समृद्ध कर सकते हैं, और सेल प्रकार विशिष्ट एंटीबॉडी की एक किस्म के साथ युग्मित किया जा सकता है मिश्रित कोशिका आबादी से ApoBDs अलग, ऊतक के नमूने और शारीरिक तरल पदार्थ23। इसके अलावा, हमारे संशोधित अंतर केंद्रापसारक दृष्टिकोण एक कुशल विधि को प्रदर्शित करता है ApoBDs को अलग > 90% शुद्धता23।
इस पत्र में, हम विस्तार से वर्णन हमारे प्रयोगात्मक प्रक्रिया apoptosis प्रेरण मांय करने के लिए, और पता लगाने और ApoBD गठन मात्रा । FACS-आधारित और विभेदक केंद्रापसारक-आधारित विधियों का उपयोग कर ApoBD आइसोलेशन कार्यप्रवाह भी सविस्तार और तुलना की जाती है । प्रतिनिधि डेटा प्रदर्शित करता है कि वर्णित पद्धति एक प्रभावी भविष्य ApoBD अध्ययन के लिए अत्याधुनिक उपकरण प्रदान करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
1950 के दशक में अपनी प्रारंभिक विवरण के बाद से, apoptosis के क्षेत्र के रूप में चिह्नित किया गया है, एक प्रमुख अनुसंधान क्षेत्र बनने । व्यापक ब्याज और व्यापक प्रयासों के बावजूद, विशेष रूप से ApoBDs के गठन में apoptosis के कु…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (GNT1125033 और GNT1140187) और ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (DP170103790) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था I.K.H.P.
Materials
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | – | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | – | – | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | – | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | – | – | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | – | |
| FlowJo 8.8.6 software | – | – | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | – |
References
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