처음 초 유 수 유 전후 개별 Oxytocin 분 비 뇌 핵 신생아 쥐에 있는 염증과 세포 스트레스 평가

Summary

여기, 우리가 제시 첫 초 유 먹이와 함께에서 신생아 쥐 뇌에서 뇌 핵을 분리 하는 프로토콜. 이 기술은 뇌에 영양소 부족 스트레스 연구를 enterocyte 신호에 의해 조절 되 있습니다.

Abstract

이 프로토콜의 목표 처음 초 유 수 유 전후 신생아 뇌에서 옥 시 토 신 수용 체 부유한 두뇌 핵을 분리 하는 것입니다. 대사 스트레스에 반응으로 알려진 단백질의 식 서 부 럽을 사용 하 여 뇌 핵 격리에서 측정 했다. 이 본문에 대사 스트레스 유발 영양소 부족 신경 스트레스 발생 여부를 평가 하기 위해 수행 되었다. 우리는 이전 신생아에서 영양 부족에에서 대사 스트레스 elicits 증명 하고있다. 또한, colostrum oxytocin 신생아 쥐 직감 villi 이전 및 첫 번째 피드 후에 세포질 긴장 응답, 염증, 및 autophagy 마커를 조절 한다. 바인딩과 그물 스트레스와 관련 된 단백질 마커 신호 [응급실 보호자 바인딩 면역 글로불린 단백질 (BiP), 번역 진 핵 개시 요인 2A (eIF2a), 및 eIF2a 키 니 아 제 단백질 키 니 아 제 R (p-PKR)], 2 뿐만 아니라 염증 신호 단백질 [핵 요인-κB (NF-kB)와 억제 물 κB (IkB)], 신생아 뇌 핵에서 측정 되었다 [독방 관 (국세청), paraventricular 핵 (PVN), 위에 광학 핵 (아들), 피 (CX),가 핵 (STR), 핵 및 중간 preoptic 핵 (MPO)] 첫 번째 피드 (colostrum에 의해 unprimed) 전에 전후 간호 (colostrum 여 액)의 시작. BiP/GRP78 및 p-eIF2a의 표현 되었고 unprimed에 upregulated downregulated 끝났다 국세청 조직에. NF-kB 낮은 되었고 두 조건에서 국세청, PVN, 및 아들에서 변경 되지 않은 반면 NF-kB (높은) CX, STR, 및 MPO 세포질에서 유지 되었다. 집단 BiP 및 p-eIF2 결과 스트레스 응답 일치 하는. eIf2a는 dsRNA 종속 키 (p-PKR)에 아들, CX, STR, MPO에 phosphorylated 됩니다. 그러나,는 NTS에서 (그리고 PVN에서 낮은 정도), eIf2a 다른 키 니 아 제, 일반 제어 nonderepressible-2 키 니 아 제 (GCN2)에 의해 phosphorylated 했다. 이전에 신생아 직감 enterocytes 관찰 스트레스 조절 메커니즘 일부 OTR 부유한 두뇌 지구에서 미러링할 나타납니다. 국세청 및 PVN 다른 지역에서 (아래 영양소 결핍) 다른 인 산화 메커니즘을 활용 하 고 영양 부족의 영향을 내 화 될 수 있습니다. 공동으로,이 데이터 영양소 부족 스트레스에 두뇌 응답 enterocytes colostrum 액에서 신호에 의해 상쇄 됩니다 나왔다.

Introduction

일-하-주 산 후의 과정을 통해 발생 하는 초기 두뇌 발달의 우리의 이해는 달리 상대적으로 작은 쥐에 있는 생활의 첫 번째 시간에 발생 하는 동적 변경의 무수 한에 대 한 알려져 있다. 핵심 과제는 신생아 쥐 두뇌와 개별 뇌 영역 또는 단일 세포를 분리 하 고 하이테크 도구에 대 한 요구의 작은 크기 되었습니다. 연구는 종종 유전자 녹음 방송 그리고 번역 하지^1,2, 활성화 신호 분자의 기능 수준의 확고 한 이해를 포기 하지 않는 평가 합니다. 다른 식 식 레벨³의 정량화에 대 한 허용 하지 않는 참조 뇌 영역 immunohistochemistry를 사용 하 여 검사 합니다. 날짜 없음 연구 활성화 신호 경로 쥐 첫 번째 colostrum 빠른 격리와 희생과 단백질 표정 및 단백질 인 산화 서를 사용 하 여 측정 필요 개별 두뇌 지구에서 피드와 관련 된 검사 하고있다 럽. 뇌 서 더 오래 되 고 큰 머리에 수행 하는 동안 우리가 하지 P0 두뇌에 단일 셀 뇌 펀치를 수행 하는 참조를 확인 했습니다. 이 종이 상대적으로 작은 샘플에 단백질 발현을 측정 하는 상대적으로 낮은 펀치 기술 및 절차를 더럽혀 서를 사용 하 여 신생아 두뇌의 제한 된 영역을 격리 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다. 이 프로토콜은 포스트 번역 상 수정 단백질 식의 평가 필요로 하는 연구 질문에 대 한 적합 한 수 있습니다 (예., 인 산화) 어떤 종류의 작은 두뇌의 상대적으로 제한 된 지역에서 제공 하는 사용자는 시각적으로 아틀라스와 식별 랜드마크 관심 뇌 영역을 식별할 수 있습니다.

이 기술은 신생아 쥐 첫 초 유 먹이 옥 시 토 신 (OT)에서 풍부한 결과로 뇌에서 발생 하는 변화를 이해 하 개발 되었다. OT는 오랫동안 우유 실망 하 고 자 궁 수 축을 자극 하는 기능에 대 한 알려져 있다. 그러나, 연장 전 지금 많은 신체 기능 및 동작⁴의 규정에 다양 한 역할을 재생으로 알려져 있습니다. 예, OT, 스트레스와 적응 affiliative 동작⁵와 함께에서 염증 반대 위 비우는 지연 고 장 전송 속도가 느려집니다. OT 수용 체 (OTR) 장 신경에 장 상피^6,,78확인 되었습니다. OT의 위장 효과 초기 산 후 기간 동안 유아에 특히 중요 하다. 예를 들어, 모유 수 유 신생아 용기^9,10, 상당한 양의 OT의 납기와 연결 되어 있으며 데이터 표시는 OTR 기간⁸유아 우유 중 십이지 장 villi에 무 겁 게 overexpressed입니다.

창 자 셀 라인을 사용 하 여 생체 외에서 실험 세포 수준에서 보여준 그 oxytocin 변조 신호 통로^11,12 스트레스에 중요 한 분자 및 단백질의 번역에 규제 역 ¹². 이러한 연구 우유, 어머니, exogenous 옥 시 토 신 등의 구성 요소는 세포 스트레스¹³을 줄이기 위해 신생아에 펼쳐진된 단백질 응답에서 중요 한 것이 좋습니다.

Vivo에서 그리고 생체 내 전 연구 colostrum OT 신생아 쥐 직감 villi에 세포질 긴장 응답, 염증, 및 autophagy 마커 변조 나타났습니다. 신생아 enterocytes 고통을 luminal 그들 측에 상당한 세포 스트레스 용기 colostrum^14,15 및 OT⁹ 과 같은 호르몬을 포함 하 여 수많은 단백질에 어머니 로부터 microbiota에 동시에 노출 되 면 ^{, 10 , 16}.

OT의 효과 뇌에 공부¹⁷되었습니다. 그러나, 이른 출생 후 기간 동안에 보여주었다 OT 신호 메커니즘 있다 하지 두뇌에서 연구 되었습니다. 이 종이에 신생아 쥐 brainstem에 시상 하 부 전기 이동 법을 사용 하 여 개별 뇌 핵을 분리 하는 방법 고립 된 뇌 영역을 프로 파일링 하는 데 사용 됩니다. 이 방법의 전반적인 목표는 두뇌 지역 출생, 유아, 최저 폐해/신경 인덱스와 뇌 조직에 첫 번째 우유 전후에 최대한 가까이에서 신호 하는 세포의 상태를 캡처. 이 기술 개발에 대 한 근거는 ex vivo 연구는 자동화 된 서 부 럽을 사용 하 여 신경의 더 균일 컬렉션 신생아 강아지에서 제한, 미세한 뇌 영역의 급속 한 격리에 대 한 허용 방법론, 상대적으로 작은 해 부 샘플에 매우 일관 된 결과 제공. 이전 작업의 단점에는 더 심한 해 부 (뇌 조각 또는 뇌)와 더 오래 된 동물^18,19포함 되어 있습니다. 젊은 새끼의 두뇌는 매우 동적, 파도 출생 후 glial 차별화의 특징입니다. 강아지의 첫 번째 먹이 의해 영향을 하는 두뇌 변화를 공부 하기 위하여 재현 해 부와 제한 신경 핵을 공부는 필요 합니다.

두뇌 개발 뇌 영역에 미치는 영향 거의 공부 하는 반면 우유 피드 일반적으로 (예를 들어 enterocytes^20,21), 건강 또는 유전자 표현에 미치는 면역과 영양 영향에 대 한 분석 이다. 뇌 기능에 용기에 우유 운송의 효과 직감 cholecystokinin 수용 체 vagal 릴레이 세포내 신호 통로²²하지만 뇌 간 핵에 관하여 분석 했다. 임신²³, 동안 어머니의 영양 부족에 개발 신생아 두뇌의 취약성에 광대 한 문학이 있다 하지만 스트레스와 염증 신호를 다루지 않습니다. 중요 한 것은, 현재 메서드는 내장 자극의 vagal 릴레이에서 혈액 태어난 colostrum 자극 격리 하루 0 쥐 신생아에서 현상 이용 합니다. 이것은 소위 스트레스 hypo-응답 기간 미 성숙한 핵 tractus solitarius (국세청)에 의해 특징 이다-국세청, paraventricular 핵 (PVN)을 제한 하는 출생^24,25 직후 hypothalamic 회로 및 supraoptic 핵 (아들) 혈액 태어난 자극에 신호.

이 방법은 여러 신호 통로의 분석에 대 한 유용 하 고 상대적으로 제한 신경 세포는 뇌 조직 쥐, 치료의 어떤 종류 또는 어머니는 도전 여부 이외에 출생 후 하루-0에서 수확 동안에 임신. Colostrum 미리 신호 먹이 대 공급의 효과 대 한 새끼를 분석할 수 있습니다. 풍부한 단백질 수율 대 가난한 뇌 영역 사이의 신호를 비교할 때이 메서드는 모세 혈관 단백질 항 원의 면역 정량에 병렬 실행의 polypeptide 밴드의 총 단백질의 모 세관에 결정을 수 있습니다. 이 메서드는 표준 양적 곡선 없이 같은 항 체와 모 세관 당 총 단백질에 대 한 참조를 얻은 결과의 임의의 단위를 사용 하 여 양적 비교 수 있습니다. 다른 항 체에 의해 얻은 결과 비교 하는 것은 양적 표준 곡선을 사용 하 여만 가능 합니다.

이 메서드는 양방향 신호 용기와 뇌 간에 발생 함수 두 기관²⁶에 영향을 미칠 수의 평가 대 한 허용. 광범위 하 게 공부 하고있다 최근 몇 년 동안²⁷, oxytocin 및 음식 섭취 사이 협회 증가 oxytocin 신호 및 양분 가용성 사이의 링크를 지원 합니다. 이러한 연구도 대화 개념 적자 hypothalamic oxytocin 신호에 감소와 함께 결합 된다 에너지를 지원 합니다.

두뇌 활동에 OT의 효과의 이전 학문 유도 창 자 염증 vagotomy²⁸내 화물 있던 hypothalamic PVN, 편도, 및 piriform 피 질에 cFos 전사 elicited 설명 했다. 그러나, secretin와 OT의 조직의 주입 뇌 cFos 응답²⁸창 자 자극된 염증 반응으로 감소. 이 외 인 OT의 효과 vagal 릴레이, 지역 postrema^6,29통해 수행 하는, 혈액을 매개로 한 신호 분자를 통해 가능 하 게 다른 경로 의해 실시 됐다 제안 했다.

이 연구에서 이전에 관찰 세포 스트레스 신호 경로 두뇌에서 평가 됐다. 가설 우유 구성 요소 보호 하거나 미생물 및 다른 대사 산물을 창 자 침투성에 염증의 영향을 지연 및 차례 차례로,에 효과 두뇌 기능 이었다. BiP colostrum¹³, 못쓰게 전후 villi, 있는 신호 대 IkB 명확한 대립 차이 여전히 개발 하는 과정에서 신생아의 두뇌가 colostrum 유도 직감 신호 감지 수 있습니다 제안 했다.

바인딩과 그물 스트레스와 관련 된 이전 용기 실험에 사용 하는 신호 단백질 마커를 측정 했다. 그들은 응급실 보호자 BiP, 번역 개시 인자 eIF2a (는 스트레스 응답 통합자³⁰역할), eIF2a 키 니 아 제 p 포함-PKR, 그리고 두 염증 신호 단백질 (NF-kB와 그 억제제, IkB).

6 뇌 영역 성인 분 비 또는 OT에 응답에서 자신의 능력에 따라 선택 되었다. 국세청, 위 정도에 위치한 내장 입력의 첫 번째 릴레이 이며 직접 용기³¹ 및 가능 하 게 혈액 태어난 cytokines, 독 소, 그리고 인접 한 지역 postrema³²통해 호르몬 vagal 감각 신경 세포에서 신호를 받습니다. PVN, supraoptic 핵 (아들)가 핵 (STR), 대뇌 피 질 (CX), 그리고 중간 preoptic 핵 (MPO)는 국세청을 통해 창 자에서 신호 수신.

결과 즉시 산 후 기간 동안 colostrum 못쓰게 이전 직후 첫 번째 먹이 국세청 PVN과 아들에 비해 다른 세포 스트레스 반응을 보여주었다. CX에 신호, STR, 및 MPO 달랐다 PVN과 아들에서 뿐만 아니라. 이전 셀 스트레스와 염증에에서 변조 표시 OT의 고유 보호 기능은 가능성이 뇌의 일부 지역에 의해 감지 됩니다. 공동으로, 데이터는 세포 수준에서 출생, 후 첫 번째 시간 동안 두뇌 응답 영양소 부족와 관련 된 대사 스트레스를 나타냅니다. 데이터는 또한 피드 colostrum의 변조 효과의 방향과 범위는 지역에 따라 다릅니다 및 일부 지역에서 그들은 이전에 표시 된 OT 효과 거울을 보여줍니다.

Protocol

이 연구는 기관 동물 관리 및 사용 컬럼비아 대학과 뉴욕 주립 정신 연구소에서 위원회에 의해 승인 되었다. 1. 조직 준비 공급 업체에서 초과 임신 쥐를 주문. 따라 초과 임신 쥐 주 그들의 도착 후에 그들의 성장 인체를 관찰 하 고 그 후 찾고 새끼 예상된 배달 날짜에 감 금 소를 검사 하 여 모든 2 시간 배달 시작 될 때까지. Timeli는에 설명 된 대로 그들?…

Representative Results

총 단백질 기준으로 immunoreactivity의 대표 밴드 매우 낮은 수확된 단백질으로 뇌 핵이 다는 것을 보여줍니다. 이 정식 서쪽 오 점에 비해 매우 중요 한 자동화 된 서쪽 오 점 기술 사용을 해야 합니다. 이 방법은 모 세관 당 레인 서쪽 오 점에 비해 당 더 적은 fortyfold 단백질으로 실행할 수 있습니다. 뇌 핵에서 BiP 수준에 colostrum 못쓰…

Discussion

이산의 서에 대 한 기술, OTR 풍부한 뇌 핵 신생아 쥐 두뇌에서이 문서에 제공 됩니다. 뇌에 잘 특징이 핵 내 에서도 매우 신경 전문는 잘 인식 된다. 특정 OTR이 풍부한 핵을 높은 재현성 이렇게 강력한 가설 테스트 수 있습니다. 자동화 된 서 부 럽을 사용 하 여, 일관성과 결과의 재현성 더 개량 되었다. 동안이 기술의 제한 겸손 뇌 펀치 다양성; 이 기술은 단일 셀, 전체 뇌 또는 뇌 조각 접근 미리를 …

Materials

Bradford solution	Bio Rad
Protein lysis kit	Protein simple	CBS403	Bicine/CHAPS
WES kits	Protein simple	WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate	Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a	Cell Signaling technology	SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	2103
Rabbit anti-phospho-PKR	Millipore	Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	12297
rabbit mAb anti-GAPDH	Cell Signaling technology	2118
mouse mAb anti-phospho-IKB	Cell Signaling technology	9246
mouse mAb anti-IKB	Cell Signaling technology	4814
rabbit anti-BiP	Cell Signaling technology	3183
Rabbit anti GCN2	Cell Signaling technology	3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2	BIORBYT	T899
pregnant Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories
Punch device	WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core	0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50