Beoordeling van cellulaire Stress en ontsteking in Discrete oxytocine-afscheidende kernen van de hersenen in de neonatale Rat vóór en na de eerste biest voeding

Summary

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van de kernen van de hersenen in de neonatale rat hersenen in combinatie met het eerste biest voeden. Deze techniek maakt het mogelijk de studie van nutriënten insufficiëntie stress in de hersenen zoals gemoduleerd door enterocyte signalering.

Abstract

Het doel van dit protocol is te isoleren van oxytocine-receptor rijke hersenen kernen in de neonatale hersenen vóór en na de eerste biest voeding. De expressie van eiwitten bekend om te reageren op een metabole stress werd gemeten in de hersenen-kernen isolaten gebruikend het westelijke bevlekken. Dit werd gedaan om te beoordelen of metabole stress-geïnduceerde nutriënten insufficiëntie in het lichaam neuronale stress veroorzaakt. Wij hebben eerder aangetoond dat nutriënten insufficiëntie in pasgeborenen metabole stress in de darm lokt. Bovendien, biest oxytocine moduleert cellulaire stress respons, ontsteking, en autophagy markeringen in pasgeboren rat gut villi vóór en na de eerste diervoeders. Signalering eiwitten markeringen die is gekoppeld aan het endoplasmatisch reticulum-stress [ER chaperon bindend immunoglobuline-proteïne (BiP), eukaryote vertaling initiatie factor 2A (eIF2a), en eIF2a kinase proteïne kinase R (p-PKR)], evenals twee ontsteking-signalering eiwitten [nucleaire factor-recombination (NF-kB) en remmer recombination (IkB)], werden gemeten in pasgeboren hersenen kernen [kern van de eenzame tractus (NTS) paraventricular nucleus (PVN), supra-optische kern (zoon), cortex (CX), striatum kernen (STR), en mediale preoptic nucleus (MPO)] vóór de eerste feed (unprimed door biest) en na het begin van de verpleegkunde (primer door biest). Uitdrukking van BiP/GRP78 en p-eIF2a waren upregulated in unprimed en werden in primer NTS weefsel. NF-kB werd behouden (hoog) in het cytoplasma CX, STR en MPO overwegende dat NF-kB lager en ongewijzigd in NTS, PVN en zoon in beide voorwaarden was. De collectieve BiP en p-eIF2 bevindingen zijn consistent met een stress-respons. eIf2a was in de zoon, CX, STR en MPO phosphorylated door dsRNA afhankelijk kinase (p-PKR). Echter was in de NTS (en in mindere mate in de PVN), eIf2a phosphorylated door een ander kinase, algemene controle nonderepressible-2 kinase (GCN2). De stress-modulerende mechanismen eerder waargenomen in pasgeboren darm enterocyten lijken te worden weerspiegeld in bepaalde hersengebieden OTR-rijk. De NTS en de PVN kan gebruik maken van een mechanisme van de verschillende fosforylatie (onder voedingsstoffen tekort) vanuit andere gebieden en worden vuurvaste aan de gevolgen van nutriënten insufficiëntie. Collectief, suggereren deze gegevens dat hersenen reacties op nutriënten insufficiëntie stress worden gecompenseerd door signalering van enterocyten biest-primer.

Introduction

In tegenstelling tot ons begrip van de vroege ontwikkeling van de hersenen die zich voordoen in de loop van dagen-naar-weken postpartum, is relatief weinig bekend over de talloze dynamische veranderingen die zich voordoen in de eerste uren van het leven bij ratten. Een belangrijke uitdaging is het kleine formaat van de neonatale rat hersenen en een eis van high-tech hulpmiddelen te isoleren van de afzonderlijke hersengebieden of afzonderlijke cellen. Studies schatten vaak gene transcriptie en niet vertaling^1,2, dat een stevige begrip van functionaliteitsniveaus van geactiveerde signalering moleculen niet geeft. Anderen bekijken expressie met behulp van immunohistochemistry aan referentie hersengebieden, wie niet voor de kwantificering van expressie niveau^{3 verstrekken doet}. Geen studie tot op heden heeft de activering van de trajecten die zijn gekoppeld aan de eerste biest ratten feed in discrete hersengebieden, waarvoor snelle isolatie en offer en meting van eiwit expressie en proteïne fosforylatie met behulp van Western signalering bevlekken. Terwijl op oudere en grotere hersenen hersenen microdissection wordt uitgevoerd, hebben we een verwijzing uitvoeren van een niet-eencellige hersenen punch in de hersenen van een P0 niet geïdentificeerd. Dit document stelt een protocol voor het isoleren van beperkte regio’s van de neonatale hersenen met behulp van een relatief low-tech punch techniek en een Western-blottingtechniek voor het meten van de eiwituitdrukking in relatief kleine steekproeven. Dit protocol kan worden geschikt voor onderzoeksvragen die de beoordeling van eiwit expressie en posttranslationele modificaties vereisen (bv., fosforylatie) in relatief beperkte regio’s van de kleine hersenen van alle soorten, op voorwaarde dat de gebruiker kan visueel inleven in de regio van de hersenen van belang een atlas en herkenbare monumenten.

Deze techniek werd ontwikkeld om te begrijpen van de veranderingen in de hersenen als gevolg van de neonatale ratten eerste biest feed, die is rijk aan oxytocine (OT). OT is lang gekend voor haar vermogen te stimuleren van melk laat-down en uteriene contractie. Echter, OT is nu bekend dat een brede waaier van rollen te spelen bij de regulering van vele lichaamsfuncties en gedrag⁴. Bijvoorbeeld, OT verzet zich tegen stress en ontsteking in combinatie met adaptieve affiliërend gedrag⁵, vertraagt het leegmaken van de maag en intestinale transit vertraagt. OT receptoren (OTR) geconstateerd in de darmen neuronen en intestinale epitheel^6,7,8. De gastro-intestinale effecten van OT zijn vooral belangrijk voor de baby tijdens de vroege postnatale periode. Bijvoorbeeld, borstvoeding wordt geassocieerd met de levering van aanzienlijke hoeveelheden OT aan de neonatale gut^9,10, en uit de gegevens blijkt dat de OTR is zwaar overexpressie in duodenale villi tijdens de melk periode⁸zuigen.

In vitro experimenten met behulp van een gut cellijn hebben aangetoond op cellulair niveau dat oxytocine moduleert belangrijke moleculen in de stress signalering traject^11,12 en een regulerende rol speelt in de vertaling van eiwitten ¹². deze studies suggereren dat onderdelen van melk, met inbegrip van exogene oxytocine van de moeder, belangrijk in de reactie van de ongevouwen eiwitten bij pasgeborenen zijn te verminderen van cellulaire spanning¹³.

In vivo en ex vivo studies hebben aangetoond dat biest OT de cellulaire stress respons, ontsteking, en autophagy markers in pasgeboren rat gut villi moduleert. Pasgeboren enterocyten lijden aanzienlijke cellulaire stress aan hun luminal kant wanneer de darm wordt gelijktijdig blootgesteld aan microbiota van de moeder in biest^14,,¹⁵ en talrijke proteïnen, met inbegrip van hormonen zoals OT^{9 , 10 , 16}.

De effecten van OT op de hersenen geweest bestudeerde¹⁷. De OT signalering mechanismen aangetoond in de darm tijdens de vroege postnatale periode zijn echter niet in de hersenen bestudeerd. In dit document wordt een methode voor het isoleren van discrete hersenen kernen in de hersenstam neonatale rat en hypothalamus met behulp van elektroforese gebruikt profileren geïsoleerde hersengebieden. Het algemene doel van deze methode is om vast te leggen van de staat van cel signalering in hersengebieden zo dicht mogelijk bij de geboorte, vóór en na de eerste melk zuigen, in hersenweefsel met de laagste gliale/neuronale index. De reden voor de ontwikkeling van deze techniek is dat het mogelijk maakt voor de snelle isolatie van beperkte, microscopische hersengebieden in neonatale pups met een meer homogene verzameling van neuronen voor ex vivo studies met behulp van een geautomatiseerde westelijke bevlekken methodologie, aanbieden zeer consistente resultaten op relatief kleine ontleed monsters. Een tekortkoming van voorafgaande werk omvat meer bruto dissectie (hersenen segmenten of hele hersenen) en oudere dieren^18,19. De hersenen van jonge pups zijn ongelooflijk dynamisch, met golven van gliale differentiatie na de geboorte. Om te kunnen studeren hersenen wijzigingen beïnvloed door de pups eerste voeding, is studeren beperkt neuronale kernen met reproduceerbare dissectie noodzakelijk.

Melk feed is meestal geanalyseerd voor de immunologische en nutritionele gevolgen daarvan voor de gezondheid of gen expressie (bijvoorbeeld in de enterocyten^20,21) Overwegende dat het effect daarvan op hersengebieden tijdens de ontwikkeling van de hersenen zelden wordt bestudeerd. Het effect van melk doorvoer in de darm op hersenfunctie werd geanalyseerd met betrekking tot de darm Cholecystokinine receptoren vagale estafette aan kernen van de hersenstam, maar niet aan intracellulaire signalering trajecten²². Er is een enorme literatuur op de kwetsbaarheid van de ontwikkelende hersenen van de pasgeborene voor ondervoeding van moeders tijdens zwangerschap²³, maar ook de stress en ontsteking signalen niet worden behandeld. Nog belangrijker is, is de huidige methode maakt gebruik van een fenomeen in de dag-nul rat pasgeborenen waarmee de bloed-geboren biest prikkels van vagale relay van viscerale stimuli worden geïsoleerd. Dit is de zogenaamde stress hypo-reactievermogen periode gekenmerkt door onrijpe nucleus tractus solitarius (NTS)-hypothalame circuit onmiddellijk na de geboorte^24,25 , die beperkt NTS, paraventricular nucleus (PVN), en supraoptic nucleus (zoon) signalen op stimuli bloed komaf.

Deze methode is nuttig voor analyse van meerdere signaalroutes en relatief beperkt tot neuronale cellen, mits hersenweefsel wordt geoogst op postnatale dag-0 bij ratten, naast of moeders zijn aangevochten of niet door enige vorm van behandeling tijdens de zwangerschap. Nesten kunnen worden geanalyseerd voor de effecten van colostrum feed versus pre voederen signalering. Bij het vergelijken van signalen tussen hersengebieden met armen versus rijke eiwit opbrengst, kan deze methode in-capillair bepaling van totaal eiwit van de polypeptide bands in haarvaten lopen parallel aan de immuun-kwantificatie van eiwit antigenen. Deze methode kan de kwantitatieve vergelijking, met behulp van willekeurige eenheden, van de resultaten verkregen door het dezelfde antilichaam zonder standaard kwantitatieve curven en verwijzing naar totaal eiwit per capillair. Het vergelijken van resultaten die zijn verkregen door verschillende antilichamen is mogelijk alleen met behulp van kwantitatieve standaard curven.

Deze methode voor de beoordeling van bidirectionele signalering die zich voordoen tussen de darm en de hersenen en dat kan van invloed zijn functie in beide organen²⁶toegestaan. De associatie tussen oxytocine en voedsel inname, die is uitgebreid bestudeerd in de afgelopen jaren²⁷, ondersteunt een verband tussen verhoogde oxytocine signalering en de beschikbaarheid van nutriënten. Deze studies ondersteunen ook het omgekeerde concept die energie die tekorten zijn in combinatie met reducties in de hypothalamische oxytocine signalering.

Eerdere studies van het effect van OT op hersenactiviteit aangetoond dat ontsteking van de darm van de geïnduceerde ontlokte CFO’s transcriptie in hypothalame PVN, amygdala en piriform cortex, die vuurvaste vagotomy^{28 was}. Systemische infusie van OT met secretine daalde echter de hersenen CFO’s reactie op de uitgelokt ontstekingsreactie in de darm²⁸. Dit stelde dat het effect van exogene OT werd uitgevoerd door routes dan vagale Relais, eventueel via bloed overgedragen signalering moleculen doorgevoerd op het gebied postrema^6,29.

In deze studie, werden de cellulaire stress signaalroutes die eerder in de darm hebben waargenomen beoordeeld in de hersenen. De hypothese was dat melkbestanddelen kunnen beschermen of uitstellen van het effect van ontsteking op de doorlaatbaarheid van de darm aan microbiële en andere metabolieten, en op zijn beurt, de gevolgen voor de hersenfunctie. De duidelijke antagonistische verschillen in IkB versus BiP signalering gevonden in villi, vóór en na de priming biest¹³, stelde dat de hersenen van pasgeborenen, nog steeds bezig, deze darm biest-geïnduceerde signalen kunnen voelen.

Signalering eiwitten markeringen gebruikt in vorige gut experimenten die gekoppeld aan het endoplasmatisch reticulum-stress zijn werden gemeten. Zij omvatten de ER chaperon BiP, vertaling initiatie factor eIF2a (die dient als een stress reactie integrator³⁰), eIF2a kinase p-PKR, en twee ontsteking-signalering eiwitten (NF-kB en de Inhibitor van de omwenteling, IkB).

Zes hersengebieden op basis van hun vermogen in volwassenen afscheiden of reageren op OT werden gekozen. De NTS, gelegen op de bovenste medulla, is de eerste slag van de viscerale input en ontvangt directe signalering van vagale sensorische neuronen in de darm³¹ en eventueel bloed-geboren cytokines, toxines en hormonen via het aangrenzende gebied-postrema-³². De PVN, supraoptic nucleus (zoon), striatum kernen (STR), hersenschors (CX) en mediale preoptic nucleus (MPO) ontvangen signalering uit de darm via de NTS.

Resultaten toonden aan dat de cellulaire stressrespons gedurende de onmiddellijke postnatale periode vóór biest priming en onmiddellijk na de eerste voeding verschilt in NTS in vergelijking met de PVN en zoon. Signalering in CX, STR, en MPO verschilden van die van de PVN en zoon, als goed. De afzonderlijke beschermende functies van OT om te moduleren cel stress en ontsteking in de darm zijn waarschijnlijk gevoeld door sommige gebieden van de hersenen. Collectief, blijkt uit de gegevens dat op het cellulaire niveau, tijdens de eerste uren na de geboorte, de hersenen op de metabolische stress nutriënten insufficiëntie is gekoppeld reageert. Uit de gegevens blijkt ook dat de omvang en de richting van de effecten van de feed biest regio-afhankelijk zijn, en dat in sommige regio’s ze OT effecten die zijn aangetoond eerder in de darm weerspiegelen.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik comités op Columbia University en de New York State psychiatrische Institute. 1. de weefsels voorbereiding Getimede zwangere ratten bij de leverancier bestellen. Volg getimede zwangere ratten door het observeren van hun groeiende buikjes in de weken na hun aankomst en vervolgens op zoek naar pups op de verwachte leverdatum door de inspectie van de kooi elke 2 h tot levering begint. Pups me…

Representative Results

De representatieve bands van immunoreactivity ten opzichte van de totale proteïne blijkt dat er hersenen kernen met zeer lage geoogste eiwit. Dit vereist het gebruik van de geautomatiseerde westelijke vlek-techniek, die zeer gevoelige in vergelijking met de canonieke westelijke vlek. Deze aanpak kan worden uitgevoerd met fortyfold minder eiwit per capillair ten opzichte van de per-baan in Western blots. Differentiele effecten van …

Discussion

Een techniek voor microdissection van discrete, OTR-rijke kernen van de hersenen in de neonatale rat hersenen wordt gepresenteerd in deze white paper. Het is goed herkend dat neuronen zijn zeer gespecialiseerd, zelfs binnen goed gekarakteriseerd kernen in de hersenen. Deze zeer reproduceerbaar aanpak te isoleren van de specifieke OTR-rijke kernen stelt gebruikers robuuste hypothese te testen. Met behulp van geautomatiseerde westelijke bevlekken, werden de samenhang en de reproduceerbaarheid van de resultaten verder verbe…

Materials

Bradford solution	Bio Rad
Protein lysis kit	Protein simple	CBS403	Bicine/CHAPS
WES kits	Protein simple	WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate	Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a	Cell Signaling technology	SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	2103
Rabbit anti-phospho-PKR	Millipore	Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	12297
rabbit mAb anti-GAPDH	Cell Signaling technology	2118
mouse mAb anti-phospho-IKB	Cell Signaling technology	9246
mouse mAb anti-IKB	Cell Signaling technology	4814
rabbit anti-BiP	Cell Signaling technology	3183
Rabbit anti GCN2	Cell Signaling technology	3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2	BIORBYT	T899
pregnant Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories
Punch device	WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core	0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50