Les processus d’invasion du cancer de la vessie représentent des occasions de biomarqueurs et de développement thérapeutique. Ici, nous présentons un modèle d’invasion de cancer de la vessie qui intègre la culture 3D des sphéroïdes de tumeur, Time-lapse imagerie et microscopie confocale. Cette technique est utile pour définir les caractéristiques du processus invasif et pour le dépistage des agents thérapeutiques.
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Article de méthode
Système de Culture cellulaire 3D pour étudier l’Invasion et l’évaluation thérapeutique dans le Cancer de la vessie
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cancer de la vessie est un problème de santé important. On estime que plus de 16 000 personnes mourront cette année aux Etats-Unis d’un cancer de la vessie. Alors que 75 % des cancers de la vessie sont non invasif et peu susceptible de métastaser, environ 25 % évoluer vers un modèle de croissance invasive. Jusqu'à la moitié des patients atteints de cancers invasifs développera la rechute métastatique létale. Comprendre le mécanisme de progression invasive dans le cancer de la vessie est donc cruciale pour prédire des résultats pour les patients et de prévenir les métastases mortelles. Dans cet article, nous présentons un modèle d’invasion du cancer en trois dimensions qui permet l’incorporation des cellules tumorales et stromales composants pour reproduire in vivo les conditions rencontrées dans le microenvironnement de tumeur de la vessie. Ce modèle offre la possibilité d’observer le processus invasif en temps réel en utilisant l’imagerie Time-lapse, interroger les voies moléculaires impliquées utilisant des composés confocale par immunofluorescence, imagerie et écran risquent de bloc invasion. Ce protocole met l’accent sur le cancer de la vessie, mais il est probable que des méthodes similaires pourraient servir à examiner l’invasion et la motilité dans d’autres types de tumeur.
Introduction
Invasion est une étape essentielle dans la progression du cancer, qui est nécessaire pour les métastases et est associé à une survie plus faible et de mauvais pronostic chez les patients. Dans le cancer de la vessie humaine, la malignité plus courante du tractus urinaire, ce qui provoque environ 165 000 décès par an dans le monde entier, pronostic, traitement et stade de cancer sont directement liés à la présence ou l’absence d’invasion1. Environ 75 % des cas de cancer de la vessie sont envahissantes non musculaires et sont gérés avec résection locale. En revanche, les cancers de la vessie envahissement musculaire (environ 25 % des cas) sont de....
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Protocole
1. croissance du Cancer sphéroïdes
-
De plus en plus de lignées cellulaires
- Cellules de cancer vessie humaine culture sous adherent classique des conditions de culture de cellules et de maintiennent dans un incubateur à 37 ° C livré avec 5 % de CO2. Maintenir les cellules à < confluency 90 %.
Remarque : les milieux de Culture utilisés est de Dulbecco modifié minimal médias essentiels (DMEM) contenant 4,5 g/L de D-glucose, L-Glutamine, pyruvate de sodium 110 mg/L et fourni avec 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) tout au long de ce protocole. - Un jour avant le début de l’expérience, trypsinize (à l’aide de 0,25 % ....
- Cellules de cancer vessie humaine culture sous adherent classique des conditions de culture de cellules et de maintiennent dans un incubateur à 37 ° C livré avec 5 % de CO2. Maintenir les cellules à < confluency 90 %.
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Résultats
Création de sphéroïde de tumeur invasive de la vessie cancer exige la formation des sphéroïdes Fluxsol tumeur de lignées cellulaires ou de tumeurs primaires. Figure 2 A montre des sphéroïdes Fluxsol développés à partir de quatre lignées cellulaires du cancer de la vessie humaine (UC9-UM, UM-UC13, UM-UC14, 253J et UM-UC18). Figure 2 B montre un sphéroïde de tumeur d’une tumeur de la vessie généré .......
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Discussion
Nous décrivons ici un modèle de sphéroïde de tumeur 3D qui permet l’observation en temps réel de l’invasion de cancer de la vessie qui est essentielle pour la progression du cancer et des métastases. Ce système se prête à l’intégration des diverses composantes stromales et cellulaires pour permettre aux enquêteurs de rappel mieux le microenvironnement de tissu où s’effectue l’invasion du cancer de la vessie. Les sphéroïdes de cancer de la vessie peut provenir de diverses sources telles que les lignées cellulaires (y comp.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier le laboratoire du Dr Howard Crawford (Université du Michigan) pour le support technique et mode de matériaux et équipements pour cette étude et Alan Kelleher pour le support technique.
Ce travail a été financé par des subventions de l’Université du Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01 a 1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Lignées cellulaires du cancer de la vessie humaine UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| Milieu de culture cellulaire DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Sérum fœtal bovin ; | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotique-Antimycosique (100x) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4 ; | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Grappe à 6 puits à fixation ultra-basse ; | Corning | 3471 | |
| Microscope inversé conventionnel | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | Utilisation générale pour la culture cellulaire et le contrôle des sphéroïdes |
| Collagène de type 1 à partir de la queue de rat, haute concentration ; | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Carl Zeiss | LSM800 | Un miscoscope confocal avec chambre climatique, imagerie multi-sites et fonction de balayage Z-stack. | |
| Micromtome cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Logiciel de traitement d’images ; | Carl Zeiss | ||
| Solution de paraformaldéhyde | Microscopie électronique Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Barrière hydrophobe PAP Pen | Vector Laboratories ; | Composé H4000 | |
| O.C.T ; | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution ; | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anticorps anti-ATDC (Trim29) | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anticorps anti-cytokératine 14 | Abcam | ab7800 | |
| Anticorps anti-vimentine | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond ; | Support de montage |
Références
- American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C.
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