Culture et la Manipulation des cellules de la crête neurale O9-1
Summary
O9-1 est une lignée de cellules multipotentes souris crête neurale. Nous décrivons ici des protocoles détaillés étape par étape pour mise en culture des cellules O9-1, différencier les cellules O9-1 dans les types spécifiques de cellules et manipuler génétiquement cellules O9-1 à l’aide de précipitation induite par le siARN ou CRISPR-Cas9 génome édition.
Abstract
Cellules neurales de crête (CNC) Effectuez la migration des cellules souches multipotentes qui peuvent se différencier en divers types de cellules et donnent lieu à de multiples tissus et organes. La lignée cellulaire O9-1 est dérivée de l’endogène CNC embryonnaires de souris et maintient ses multipotentialité. Toutefois, dans des conditions de culture spécifique, cellules O9-1 peuvent se différencier en divers types de cellules et être utilisés dans un large éventail d’applications de recherche. Récemment, avec la combinaison des études sur les souris et O9-1 cellule études, nous avons montré que l’hippopotame effecteurs de la voie de signalisation Yap et Taz jouent des rôles importants en développement craniofacial dérivé de crête neurale. Bien que le processus de culture de cellules O9-1 est plus compliqué que celle utilisée pour les autres lignées cellulaires, la lignée cellulaire O9-1 est un modèle puissant pour l’étude in vitrode la CNC. Nous présentons ici un protocole pour la culture de la lignée cellulaire O9-1 afin de maintenir ses stemness, mais aussi des protocoles permettant de différencier les cellules O9-1 dans différents types de cellules, telles que les cellules musculaires lisses et des ostéoblastes. En outre, les protocoles sont décrits pour effectuer des études de perte de fonction de gènes dans les cellules O9-1 l’utilisation CRISPR-Cas9 suppression et petit parasite-mediated RNA knockdown.
Introduction
Cellules neurales de crête (CNC) sont des cellules souches multipotentes avec une remarquable capacité migratoire et l’existence transitoire durant le développement embryonnaire. Comités nationaux sont créés entre l’ectoderme de surface et le tube neural et migre vers d’autres parties de l’embryon au cours du développement embryonnaire1. Se fondant sur leurs domaines fonctionnels, CNC peut être classées en plusieurs types différents, y compris crânienne, le tronc, vagal, sacrée et CNC cardiaque. De plus, CNC peut se différencier en plusieurs lignées cellulaires, tels que les cellules musculaires lisses, cellules osseuses et les neurones et donner lieu à divers tissus2,3. Le développement des CNC se caractérise par une série complexe d’événements morphogénétiques qui sont affinés par divers signaux moléculaires. Compte tenu de la réglementation complexe des CNC et leur importante contribution aux nombreuses structures, la dérégulation du développement NCC peut entraîner communément congenital malformations congénitales, qui représentent près de 30 % de tous les défauts de naissance humaines congénitales. Anomalies au cours du développement de la crête neurale peuvent conduire à une fente labiale/palatine, viciée nez formation, syndromes, les défauts comme une sortie du cardiaques défectueux, ou même mortalité1,4,5, 6 , 7. comprendre les mécanismes moléculaires du développement de la NCC est important pour développer des traitements pour les maladies causées par des défauts dans le développement de la NCC. Avec l’utilisation de divers in vitro et in vivo des approches8,9,10,11,12,13,14 ,15, des progrès considérables accomplis dans la recherche de la NCC. In vivo, des modèles animaux, y compris les poulets, amphibiens, poissons zèbres et la souris, ont été utilisés pour étudier le CNC1. En outre, des embryons humains ont été utilisés pour étudier le processus de migration de NCC en début de développement embryonnaire humain16. In vitro, des modèles de cellules pour les comités nationaux, tels que CNC humaine qui proviennent de la graisse sous-cutanée patiente, ont été utilisés pour étudier la maladie de Parkinson,17. La ligne O9-1 NCC, qui était à l’origine de cultures de massives des CNC endogène isolé de E8.5 souris embryons18, est un modèle cellulaire puissant pour étudier NCCs. ce qui est important, dans des conditions de culture non-différencier, cellules O9-1 sont comités nationaux de la tige-comme multipotentes. Cependant, dans diverses conditions de culture, cellules O9-1 peuvent être différenciées dans les types de cellules distingués, tels que les cellules musculaires lisses, ostéoblastes, les chondrocytes et les cellules gliales18. Compte tenu de ces propriétés, cellules O9-1 ont été largement utilisés pour les études relatives au NCC, telles que l’enquête sur le mécanisme moléculaire de défauts crânien-facial19,20.
Ici, les protocoles détaillés sont fournis pour maintenir les cellules O9-1, DIFFERENCIATION O9-1 cellules en différents types cellulaires et manipuler des cellules O9-1 en effectuant des études de perte de fonction de gènes avec CRISPR-Cas9 génome d’édition et de petits ARN interférents (siARN)- véhiculée par les technologies knockdown. Comme un exemple représentatif, l’utilisation des cellules O9-1 d’étudier Yap et Taz perte de fonction est décrite. Yap et Taz sont les effecteurs en aval de l’hippopotame, signalisation, qui joue un rôle essentiel dans la prolifération cellulaire, la différenciation et l’apoptose. La voie Hippo a aussi démontrée être important dans le développement et l’homéostasie de plusieurs différents tissus et organes, ainsi que dans la pathogenèse des maladies différentes20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Les composants principaux d’Hippo signalisation comprennent les kinases de 20 comme stérile du suppresseur tumeur Mst1/2, protéine d’échafaudage Salvador contenant du domaine WW et les kinases de homologue (Lats1/2) de suppresseur de tumeur grande. Hippo la signalisation inhibe l’activité de Yap et Taz et favorise leur dégradation dans le cytoplasme. Sans répression de Hippo, Yap et Taz peuvent effectuer des transferts en noyaux et fonction transcriptionnelles activateurs Co. Nous avons récemment démontré que spécifiquement inactivant l’hippopotame effecteurs Yap et Taz en souris CNC de signalisation à l’aide de la Wnt1cre et Wnt1Cre2SOR pilotes ont abouti à une létalité embryonnaire à E10.5 avec sévère Craniofacial défauts20. Nous avons également réalisé des études utilisant des cellules O9-1 pour enquêter sur le rôle de Yap et Taz en CNC. Pour étudier la fonction Yap et Taz dans le NCC prolifération et la différenciation, Yap et Taz knockdown cellules ont été générés dans les cellules O9-1 à l’aide de siARN, et cellules Ko Yap ont été générés en utilisant CRISPR-Cas9 génome édition. Les mêmes stratégies de perte de fonction de gène peuvent être appliqués aux gènes cibles différentes dans d’autres voies. En outre, gain de fonction des études et des essais de transfection peuvent également être appliqués aux cellules O9-1 pour étudier la régulation et la fonction du gène. Les protocoles décrits ici sont destinés à être utilisés par les enquêteurs comme guides pour la culture des cellules O9-1 pour maintenir stemness multipotentes, afin de différencier les cellules O9-1 dans les autres types de cellules dans des conditions de culture différente et pour étudier la fonction des gènes et les mécanismes moléculaires du CNC.
Protocol
Representative Results
Discussion
La CCN est un collaborateur polyvalent et clé aux différents tissus et organes au cours de la morphogenèse embryonnaire. La lignée cellulaire O9-1 maintient son potentiel à se différencier en plusieurs types de cellules différents et imite les caractéristiques in vivo des CNC, ce qui en fait un outil utile en vitro pour étudier la fonction des gènes et régulation moléculaire en CNC. Les différents statuts des cellules O9-1 peut correspondre à différents crête neurale progéniture en …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nicole Stancel, Ph.d., ELS, des Publications scientifiques de l’Institut de cardiologie de Texas, fourni un soutien éditorial. Nous remercions également les sources de financement suivantes : subvention de développement de l’American Heart Association nationale Centre scientifique (14SDG19840000 à J. Wang), le 2014 Lawrence Research Award de le Rolanette et Berthiaume Laurent osseuse maladie programme du Texas (à J. Wang ) et les instituts nationaux de santé (DE026561 et DE025873 J. Wang, DE016320 et DE019650 à R. Maxson).
Materials
| Active STO feeder cells | ATCC | ATCC CRL-1503 | Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X |
| O9-1 mouse cranial neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | 11960-044 | |
| DMEM, high glucose | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Millipore Sigma | ES-009-B | |
| Penicillin – streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-081 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS | Genesee Scientific | 25-510 | |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium | Lonza | 17-512F | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100X | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/ml | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356234 | |
| DMSO (dimethylsulfoxide) | Millipore Sigma | MX1458-6 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| Opti-MEM I (1X) | Gibco | 31985-070 | |
| Minimum essential medium, alpha 1X with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine | Corning | 10-022-CV | |
| ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | Dharmacon | L-041057 | |
| ON-TARGETplus Non-targeting Pool | Dharmacon | D-001810 | |
| ON-TARGETplus Yap1 siRNA | Dharmacon | L-046247 | |
| FCS (fetal calf serum) | |||
| ITS (insulin-transferrin-selenium ) | |||
| TGF-b3 | |||
| Ascorbic acid | |||
| BMP2 (bone morphogenetic protein 2) | |||
| Dexamethasone | |||
| B-27 supplement |
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