Culturing ומניפולציה של תאי הרכס העצבי O9-1
Summary
O9-1 הוא קו תא multipotent העכבר הרכס העצבי. כאן נתאר מפורט שלב אחר שלב פרוטוקולים culturing O9-1 תאים, המבדילים O9-1 תאים תאים מסוים סוגים של מניפולציה גנטית O9-1 תאים על-ידי שימוש בתיווך siRNA נוקאאוט או עריכה של הגנום CRISPR-Cas9.
Abstract
תאי הרכס העצבי (NCCs) מעביר multipotent תאי גזע יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים, להצמיח מרובים רקמות ואיברים. שורת התאים O9-1 נגזרת אנדוגני העכבר NCCs עובריים ושומר על multipotency שלה. עם זאת, בתנאים תרבות מסוימת, O9-1 התאים יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים, ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומי מחקר. לאחרונה, עם השילוב של העכבר מחקרים ולימודים תא O9-1, אנחנו הראו כי ההיפופוטם איתות לשביל effectors הפה, טאז תפקיד חשוב בהתפתחות ואסטתיים נגזר הרכס העצבי. למרות תהליך culturing עבור תאים O9-1 הוא מסובך יותר בשימוש עבור שורות תאים אחרים, שורת התאים O9-1 הוא מודל חזק על חקירת NCCs חוץ גופית בתוך. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור culturing הקו תא O9-1 כדי לשמור על stemness שלה, כמו גם פרוטוקולים עבור המבדילים O9-1 תאים לתוך לסוגי תאים שונים, כגון תאי שריר חלק, תאי העצם. בנוסף, פרוטוקולים מתוארים לביצוע מחקרים אובדן-של-פונקציה ג’ין בתאים O9-1 על-ידי שימוש CRISPR-Cas9 והמומנט קטן מפריעות נוקאאוט בתיווך RNA.
Introduction
תאי הרכס העצבי (NCCs) הם תאי גזע דמוי multipotent עם יכולת מדהימה נודדות, קיום חולף במהלך התפתחות עובריים. NCCs מקורם בין האאקטודרם השטח של הצינור העצבי ולהעביר אל חלקים אחרים של העובר במהלך התפתחות1. בהתבסס על תחומים פונקציונליים שלהם, NCCs יכולים להיות מסווגים לתוך מספר סוגים שונים, כולל הגולגולת, תא המטען, vagal, עצם העצה, NCCs הלב. בנוסף, NCCs ניתן להתמיין שושלות תאים מרובים, כגון תאי שריר חלק, תאים עצם הנוירונים, להצמיח רקמות שונות2,3. הפיתוח של NCCs מאופיין על ידי סדרה מורכבת של אירועים morphogenetic, כי הם יסודי על ידי אותות מולקולריים שונים. לאור מורכבות ויסות NCCs ותרומתם מבנים רבים חשוב, dysregulation של פיתוח NCC יכול להוביל בדרך כלל מולדת למומים מולדים, באיזה חשבון כמעט 30% של כל אדם מולדות מומים מולדים. ליקויים במהלך פיתוח הרכס העצבי יכול להוביל שסוע שפתיים/החיך, פגם באף צורה, תסמונות, פגמים כגון מערכת יצוא לב פגומים או אפילו תמותת1,4,5, 6 , 7. הבנת המנגנונים המולקולריים של פיתוח NCC חשוב לפיתוח טיפולים עבור מחלות הנגרמות על ידי ליקויים בהתפתחות NCC. עם השימוש השונים במבחנה , ויוו מתקרב8,9,10,11,12,13,14 ,15, התקדמות ניכרת נעשתה במחקר NCC. In vivo, מודלים בבעלי חיים, כולל עופות, דו-חיים, דג זברה ועכברים, שימשו כדי לחקור NCCs1. יתר על כן, עוברי אדם שימשו כדי לחקור את תהליך ההעברה NCC במהלך התפתחות העובר מוקדם16. במבחנה, מודלים תא NCCs, כגון NCCs האנושי, כי מקורם החולה השומן התת עורית שימשו כדי לחקור את מחלת פרקינסון17. הקו NCC O9-1, אשר נגזר במקור מתרבויות המונית של NCCs אנדוגני מבודד E8.5 העכבר עוברי18, הוא מודל חזק תא ללמוד NCCs. חשוב, בתנאים תרבות שאינם מבדילים, תאים O9-1 NCCs גזע דמוי multipotent. עם זאת, בתנאים תרבות שונות, תאים O9-1 יכול להיות מובחן סוגי תאים מכובדים, כגון תאי שריר חלק, תאי העצם, chondrocytes וגלייה18. לאור מאפיינים אלה, תאים O9-1 שימשו בהרחבה ללימודים הקשורות NCC, כגון חקירת המנגנון המולקולרי של הפנים הגולגולתי פגמים19,20.
כאן, פרוטוקולים מפורט ניתנים לשמירה על תאי O9-1, המבדילים O9-1 תאים לתוך לסוגי תאים שונים של מניפולציה O9-1 תאים על-ידי ביצוע גנים לימודי אובדן-של-פונקציה עם עריכה הגנום CRISPR-Cas9 ו- RNA מפריעות קטן (siRNA)- מתווכת הטכנולוגיות תמונות ציפורים. בתור דוגמא מייצגת, מתואר השימוש O9-1 תאים כדי לחקור הפה , טאז אובדן-של-פונקציה. הפה טאז effectors במורד הזרם של ההיפופוטם איתות, אשר ממלא תפקיד קריטי התפשטות תאים, בידול ולאחר אפופטוזיס בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. מסלול היפו גם הוכח להיות חשוב פיתוח, הומאוסטזיס של מספר ברקמות שונות ואיברים, וכן בפתוגנזה של מחלות שונות20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. מרכיבי הליבה של היפו איתות כוללים את הגידול משתיק קול סטרילית כמו 20 kinases Mst1/2, WW המכילות תחום סלבדור לגרדום חלבונים kinases homolog (Lats1/2) משתיק קול של גידול גדול. היפו איתות מעכב פעילות הפה, טאז ומקדם שפלותם בציטופלסמה. ללא דיכוי של היפופוטם, הפה, טאז יכול translocate לתוך גרעין האטום, לתפקד כמו תעתיק שיתוף activators. אנחנו לאחרונה הראה כי במיוחד inactivating ההיפופוטם איתות effectors הפה, טאז עכבר NCCs באמצעות Wnt1שלcre וכתוצאה Wnt1Cre2SOR נהגים עובריים lethality ב E10.5 עם חמור פגמים ואסטתיים20. אנחנו גם הופיעו מחקרים באמצעות תאים O9-1 כדי לחקור את התפקיד של הפה ו Taz ב- NCCs. כדי לחקור הפה, טאז פונקציה NCC התפשטות, בידול, הפה , טאז נוקאאוט תאים נוצר בתאים O9-1 על-ידי שימוש siRNA, הפה נוקאאוט תאים נוצרו באמצעות עריכת הגנום CRISPR-Cas9. האסטרטגיות אובדן-של-פונקציה באותו הגן ניתן ליישם יעד אחר גנים במשעולים אחרים. בנוסף, רווח-של-תפקוד לימודי, תרביות תאים מבחני ניתן להחיל גם לתאים O9-1 ללמוד ג’ין פונקציה ורגולציה. הפרוטוקולים המתוארים כאן נועדו לשמש על ידי חוקרים מדריכים culturing O9-1 תאים כדי לשמור על multipotent stemness, על הבחנה O9-1 תאים לתוך סוגי תאים אחרים בתנאים תרבות אחרת, ועל לימוד תפקוד הגן, המנגנון המולקולרי של NCCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
NCC הוא תורם רב-תכליתי, מפתח ברקמות שונות ואיברים במהלך מורפוגנזה עובריים. שורת התאים O9-1 שומרת את הפוטנציאל להתמיין סוגי תאים שונים רבים ולאחר מחקה ויוו מאפייני NCCs, שהופך אותו כלי שימושי במבחנה ללמוד ג’ין פונקציה ורגולציה מולקולרית ב- NCCs. המצב שונה של O9-1 תאים עשויים להתאים הרכס העצ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ניקול Stancel, Ph.d., ELS, הפרסומים המדעיים במכון הלב טקסס, סיפק תמיכה העריכה. אנו מודים גם את מקורות המימון הבאים: מענק פיתוח של מדען מרכז של איגוד הלב האמריקני הלאומי (14SDG19840000 כדי ג’יי וואנג), לורנס 2014 מחקר פרס Rolanette, Berdon לורנס עצם המחלה תוכנית טקסס (כדי ג’יי וואנג ), ולא את המכונים הלאומיים לבריאות (DE026561 ו- DE025873 ג’יי Wang, DE016320, DE019650 ל ר מקסון).
Materials
| Active STO feeder cells | ATCC | ATCC CRL-1503 | Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X |
| O9-1 mouse cranial neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | 11960-044 | |
| DMEM, high glucose | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Millipore Sigma | ES-009-B | |
| Penicillin – streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-081 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS | Genesee Scientific | 25-510 | |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium | Lonza | 17-512F | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100X | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/ml | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356234 | |
| DMSO (dimethylsulfoxide) | Millipore Sigma | MX1458-6 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| Opti-MEM I (1X) | Gibco | 31985-070 | |
| Minimum essential medium, alpha 1X with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine | Corning | 10-022-CV | |
| ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | Dharmacon | L-041057 | |
| ON-TARGETplus Non-targeting Pool | Dharmacon | D-001810 | |
| ON-TARGETplus Yap1 siRNA | Dharmacon | L-046247 | |
| FCS (fetal calf serum) | |||
| ITS (insulin-transferrin-selenium ) | |||
| TGF-b3 | |||
| Ascorbic acid | |||
| BMP2 (bone morphogenetic protein 2) | |||
| Dexamethasone | |||
| B-27 supplement |
References
- Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
- Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
- Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
- Cordero, D. R., et al. Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development. American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).
- Trainor, P. A. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).
- Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. The neural crest migrating into the twenty-first century. Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).
- Zurkirchen, L., Sommer, L. Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells. Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).
- Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. Induction of the neural crest: a multigene process. Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).
- Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).
- Raible, D. W. Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways. Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Biologie du développement. 366 (1), 83-95 (2012).
- Henion, P. D., Weston, J. A. Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).
- Harris, M. L., Erickson, C. A. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).
- Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages. Development. 130 (2), 321-330 (2003).
- Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. Analysis of early human neural crest development. Biologie du développement. 344 (2), 578-592 (2010).
- Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers. Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Yumoto, K., et al. TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells. Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).
- Wang, J., et al. Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development. Development. 143 (3), 504-515 (2016).
- Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
- Wang, J., Martin, J. F. Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).
- Pan, D. The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).
- Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).
- Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues. Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).
- Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
- Moya, I. M., Halder, G. The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs. Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).
- Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Manderfield, L. J., et al. Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest. Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6, 23208 (2016).
- Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development. International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).
- Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).
- Kang, B. J., et al. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).
- Uemura, M., et al. Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).
