Cultivo e manipulação das células da crista Neural de O9-1
Summary
O9-1 é uma linhagem de células multipotentes rato crista neural. Aqui descrevemos protocolos passo a passo detalhados para cultivo de células O9-1, diferenciar células O9-1 em tipos de células específicas e manipulando geneticamente células O9-1 usando mediada por siRNA nocaute ou CRISPR-Cas9 edição do genoma.
Abstract
Células da crista neural (CNCC) estão migrando de células tronco que podem se diferenciar em diferentes tipos de células e dar origem a vários tecidos e órgãos. A linha de celular O9-1 é derivada o endógeno CNCC embrionárias de rato e mantém a sua multipotency. No entanto, em condições de cultura específica, O9-1 células podem se diferenciar em diferentes tipos de células e ser utilizadas em uma ampla gama de aplicações de pesquisa. Recentemente, com a combinação de estudos de rato e de células O9-1, mostramos que o hipopótamo efetores da via de sinalização Yap e Taz desempenham importantes funções no desenvolvimento craniofacial crista neural-derivado. Embora o processo de cultivo de células O9-1 é mais complicado do que o utilizado para outras linhas de célula, a linha de celular O9-1 é um poderoso modelo para investigar a CNCC em vitro. Aqui, apresentamos um protocolo para a linha de celular O9-1 para manter a sua stemness, bem como protocolos para diferenciar células O9-1 em diferentes tipos de células, como células de músculo liso e osteoblastos de cultivo. Além disso, os protocolos são descritos para a realização de estudos de perda-de-função do gene em células O9-1 usando CRISPR-Cas9 exclusão e pequena interferência mediada por RNA “knockdown”.
Introduction
Crista neural (CNCC) são células estaminais, como com uma notável capacidade migratória e transitória existência durante o desenvolvimento embrionário. CNCC originam entre o ectoderma superficial e o tubo neural e migra para outras partes do embrião durante o desenvolvimento embrionário1. Com base em seus domínios funcionais, CNCC pode ser classificados em vários tipos diferentes, incluindo crânio, tronco, vagal, sacral e cardíaca CNCC. Além disso, a CNCC pode se diferenciar em várias linhagens de células, como células musculares lisas, células ósseas e neurônios e dar origem a vários tecidos2,3. O desenvolvimento da CNCC caracteriza-se por uma série complexa de eventos morfogenéticas que são ajustados por vários sinais moleculares. Tendo em conta o Regulamento complexo do CNCC e suas importantes contribuições para numerosas estruturas, o dysregulation do desenvolvimento do NCC comumente pode originar defeitos congênitos do nascimento, que respondem por cerca de 30% de todos os defeitos congênitos humanos do nascimento. Anomalias durante o desenvolvimento da crista neural podem levar a fissura lábio/palato, defeito defeitos de formação do nariz, síndromes, tais como um tracto de saída cardíaca defeituosa do, ou até mesmo mortalidade1,4,5, 6 , 7. compreender os mecanismos moleculares do desenvolvimento do NCC é importante para o desenvolvimento de tratamentos para doenças causadas por defeitos no desenvolvimento do NCC. Com o uso de vários in vitro e in vivo se aproxima de8,9,10,11,12,13,14 ,15, consideráveis progressos na investigação do NCC. In vivo, modelos animais, incluindo galinhas, anfíbios, peixe-zebra e ratos, têm sido utilizados para investigar a CNCC1. Além disso, os embriões humanos têm sido utilizados para estudar o processo de migração do NCC em início de desenvolvimento de embrião humano16. In vitro, modelos de celular para CNCC, tais como CNCC humana que originou-se paciente da gordura subcutânea, têm sido utilizados para investigar a doença de Parkinson17. Linha O9-1 NCC, que foi originalmente derivada de culturas em massa da CNCC endógenas isoladas de 8.5 de embriões de rato18, é um modelo de célula poderoso para estudar CNCC. importante, em condições não-diferenciação de cultura, são células O9-1 multipotentes haste-como CNCC. No entanto, sob condições variáveis de cultura, células O9-1 podem ser diferenciadas em tipos celulares distintos, tais como células musculares lisas, osteoblastos, condrócitos e células gliais18. Devido a essas propriedades, O9-1 células têm sido amplamente utilizadas para estudos relacionados ao NCC, como investigar o mecanismo molecular de defeitos crânio-facial19,20.
Aqui, protocolos detalhados são fornecidos para manter células O9-1, diferenciar células O9-1 em diferentes tipos de células e manipulando células O9-1 através da realização de estudos de perda–função do gene com edição de genoma CRISPR-Cas9 e RNA de interferência pequeno (siRNA)- mediada por tecnologias “knockdown”. Como um exemplo representativo, é descrito o uso de células-O9-1 para estudar Yap e Taz perda de função. Yap e Taz são os efetores a jusante do hipopótamo sinalizando a via, que desempenha um papel crítico na proliferação celular, diferenciação e apoptose. O caminho de Hippo também foi mostrado para ser importante no desenvolvimento e na homeostase de diversos diferentes tecidos e órgãos, bem como na patogênese de doenças diferentes20,21,22,23 ,24,25,26,,27,28. Os principais componentes de hipopótamo sinalização incluem os tumor supressor estéril 20-como quinases Mst1/2, proteína que contém o domínio WW do andaime Salvador e as quinases de homólogo (Lats1/2) de supressor de tumor grande. Sinalização de hipopótamo inibe a atividade de Yap e Taz e promove sua degradação no citoplasma. Sem repressão do hipopótamo, Yap e Taz podem translocar em núcleos e funcionar como co-ativadores transcricionais. Recentemente mostramos que especificamente inactivar o hipopótamo sinalização efetores Yap e Taz no mouse CNCC usando o Wnt1cre e Wnt1Cre2SOR motoristas resultaram na letalidade embrionária em E10.5 com graves defeitos craniofaciais20. Também Efetuamos estudos utilizando células O9-1 para investigar o papel de Yap e Taz em CNCC. Para estudar a função Yap e Taz no NCC proliferação e diferenciação, Yap e o Taz knockdown células foram geradas nas células O9-1 usando siRNA, e células de nocaute de Yap foram geradas usando CRISPR-Cas9 edição do genoma. As mesmas estratégias de perda de função do gene podem ser aplicadas a genes-alvo diferente em outras vias. Além disso, ganho-de-função estudos e ensaios de transfeccao também podem ser aplicados às células de O9-1 para estudar a regulação e a função dos genes. Os protocolos descritos aqui destinam-se a ser utilizado por investigadores como guias para cultivo de células O9-1 para manter stemness multipotentes, para diferenciar O9-1 células em outros tipos de células sob condições de cultura diferente e para estudar a função dos genes e os mecanismos moleculares da CNCC.
Protocol
Representative Results
Discussion
O NCC é um contribuinte versátil e chave para diferentes tecidos e órgãos durante a morfogênese embrionária. A linha de celular O9-1 mantém seu potencial para se diferenciar em muitos tipos de células diferentes e imita as características na vivo do CNCC, tornando-o uma ferramenta útil em vitro para estudar a função dos genes e Regulamento molecular em CNCC. O status diferente de células O9-1 pode corresponder a diferentes crista neural progênie na vivo, dependendo das condições…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nicole Stancel, pH.d., ELS, de publicações científicas do Instituto do coração do Texas, prestou apoio editorial. Agradecemos também as seguintes fontes de financiamento: nacional Center cientista desenvolvimento Grant a associação americana do coração (14SDG19840000 de J. Wang), o prêmio de pesquisa Lawrence 2014 do Rolanette e osso Lawrence Berdon doença programa do Texas (para J. Wang ) e os institutos nacionais de saúde (DE026561 e DE025873 para J. Wang, DE016320 e DE019650 de R. Maxson).
Materials
| Active STO feeder cells | ATCC | ATCC CRL-1503 | Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X |
| O9-1 mouse cranial neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | 11960-044 | |
| DMEM, high glucose | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Millipore Sigma | ES-009-B | |
| Penicillin – streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-081 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS | Genesee Scientific | 25-510 | |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium | Lonza | 17-512F | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100X | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/ml | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356234 | |
| DMSO (dimethylsulfoxide) | Millipore Sigma | MX1458-6 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| Opti-MEM I (1X) | Gibco | 31985-070 | |
| Minimum essential medium, alpha 1X with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine | Corning | 10-022-CV | |
| ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | Dharmacon | L-041057 | |
| ON-TARGETplus Non-targeting Pool | Dharmacon | D-001810 | |
| ON-TARGETplus Yap1 siRNA | Dharmacon | L-046247 | |
| FCS (fetal calf serum) | |||
| ITS (insulin-transferrin-selenium ) | |||
| TGF-b3 | |||
| Ascorbic acid | |||
| BMP2 (bone morphogenetic protein 2) | |||
| Dexamethasone | |||
| B-27 supplement |
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