Odling och manipulering av O9-1 Neural Crest celler
Summary
O9-1 är en multipotenta mus neural crest cellinje. Här beskriver vi detaljerade stegvisa protokoll för odling O9-1 celler, differentiera O9-1 celler till specifika celltyper och genetiskt manipulera O9-1 celler med siRNA-medierad knockdown eller CRISPR-Cas9 gen editering.
Abstract
Neural crest celler (penningförfalskning) migrerar multipotenta stamceller som kan differentieras till olika celltyper och ge upphov till flera vävnader och organ. O9-1 cell linjen härstammar från den endogena mus embryonala penningförfalskning och underhåller dess multipotency. Dock viss kultur villkor, O9-1 celler kan differentieras till olika celltyper och utnyttjas i ett stort antal forskningsansökningar. Nyligen, med en kombination av mus studier och O9-1 cell, vi har visat att flodhästen signalering utbildningsavsnitt effektorer Yap och Taz spelar viktiga roller i neural crest-derived kraniofaciala utveckling. Även om culturing processen för O9-1 celler är mer komplicerad än den som används för andra cellinjer, är O9-1 cell linjen en kraftfull modell för att utreda NCCs in vitro. Här presenterar vi ett protokoll för odling raden O9-1 cell för att bibehålla dess stemness, samt protokoll för att skilja O9-1 celler till olika celltyper, såsom glatta muskelceller och osteoblaster. Dessutom beskrivs protokoll för att utföra gen förlust-av-funktion studier i O9-1 celler med hjälp av CRISPR-Cas9 radering och små störande RNA-medierad knockdown.
Introduction
Neural crest celler (penningförfalskning) är multipotenta stamceller-liknande celler med en anmärkningsvärd flyttande förmåga och övergående existens under fosterutvecklingen. NCCs härstammar mellan det ytan ektodermet och neuralrörsdefekter och migrera till andra delar av embryot under embryonal utveckling1. Baserat på deras funktionella domäner, kan penningförfalskning delas in i flera olika typer, inklusive kraniala, stam, vagala, sakrala, och hjärt NCCs. Dessutom kan NCCs differentieras till flera cell härstamningar, såsom glatta muskelceller, benceller och nervceller, och ge upphov till olika vävnader2,3. Utvecklingen av NCCs kännetecknas av en komplex serie av morphogenetic händelser som är finjusteras av olika molekylära signaler. Med tanke på den komplexa regleringen av penningförfalskning och deras viktiga bidrag till många strukturer, kan dysreglering av NCC utveckling ofta leda till medfödda missbildningar, som står för nästan 30% av alla människans medfödda missbildningar. Avvikelser under neural crest utvecklingen kan leda till kluven läpp/gomspalt, bristfällig näsa bildandet, syndrom, defekter såsom en defekt hjärt utflöde tarmkanalen, eller ens Begynna dödlighet1,4,5, 6 , 7. förstå de molekylära mekanismerna av NCC utveckling är viktigt för att utveckla behandlingar för sjukdomar som orsakas av defekter i NCC utveckling. Med användning av olika in vitro- och in-vivo närmar sig8,9,10,11,12,13,14 ,15, betydande framsteg har gjorts i NCC forskning. In vivo, djurmodeller, inklusive kycklingar, amfibier, zebrafiskar och möss, har använts för att undersöka NCCs1. Mänskliga embryon har dessutom använts för att studera processen för NCC migration i tidiga mänskliga embryots utveckling16. In vitro, cellmodeller för NCCs, såsom mänskliga NCCs som härstammar från patientens underhudsfett, har använts för att undersöka Parkinsons sjukdom17. O9-1 NCC linjen, som ursprungligen härrör från massa kulturer av endogena NCCs isolerade från E8.5 mus embryon18, är en kraftfull cell modell för att studera NCCs. allt villkor icke-göra åtskillnad mellan kultur, O9-1 celler multipotenta stamceller-liknande NCCs. Dock varierande kultur villkor, kan O9-1 celler differentieras till framstående celltyper, såsom glatta muskelceller, osteoblaster, kondrocyter och gliaceller18. Med tanke på dessa egenskaper, har O9-1 celler i huvudsak använts för NCC-relaterade studier, som undersöker den molekylära mekanismen av kraniala-ansiktsbehandling defekter19,20.
Här, detaljerade protokoll tillhandahålls för att upprätthålla O9-1 celler, differentiera O9-1 celler till olika celltyper och manipulera O9-1 celler genom att utföra gen förlust-av-funktion studier med CRISPR-Cas9 gen editering och små störande RNA (siRNA)- medierad knockdown teknik. Som ett typexempel beskrivs användningen av O9-1 celler att studera Yap och Taz förlust-av-funktion. YAP och Taz är de nedströms effektorer av flodhästen signalering utbildningsavsnitt, som spelar en avgörande roll i cellproliferation, differentiering och apoptos. Hippo vägen har också visat sig vara viktigt i utvecklingen och homeostas av flera olika vävnader och organ, liksom i patogenesen av olika sjukdomar20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Kärnkomponenterna i Hippo signalering inkluderar de tumör suppressor steril 20-liknande kinaser Mst1/2, WW domän-innehållande Salvador byggnadsställning protein och de stora tumör suppressor homolog (Lats1/2) kinaser. Hippo signalering hämmar Yap och Taz aktivitet och främjar deras nedbrytning i cytoplasman. Utan förtryck från Hippo, kan Yap och Taz translocate till atomkärnor och fungera som transkriptionell aktivatorer. Vi visade nyligen att specifikt inactivating flodhästen signalering effektorer Yap och Taz i musen NCCs med hjälp av den Wnt1cre och Wnt1Cre2SOR drivrutiner resulterade i embryonal dödlighet på E10.5 med svår kraniofaciala defekter20. Vi har även utfört studier använder O9-1 celler för att undersöka Yap och Taz i NCCs roll. För att studera Yap och Taz funktion i NCC proliferation och differentiering, Yap och Taz knockdown celler genererades i O9-1 celler med hjälp av siRNA och Yap knockout celler genererades med hjälp av CRISPR-Cas9 gen editering. Samma gen förlust-av-funktion strategier kan tillämpas på olika målgener i andra vägar. Gain-of-function studier och transfection analyser kan dessutom också tillämpas på O9-1 celler att studera geners funktion och reglering. De protokoll som beskrivs här är avsedda att användas av utredare som guider för odling O9-1 celler för att upprätthålla multipotenta stemness, för att skilja O9-1 celler till andra celltyper under olika odlingsbetingelser och för att studera geners funktion och molekylära mekanismer för NCCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
NCC är en mångsidig och viktig bidragsgivare till olika vävnader och organ under embryonala morfogenes. O9-1 cell linjen underhåller dess potential att differentieras till många olika celltyper och härmar i vivo egenskaper penningförfalskning, gör det en användbar in vitro- verktyg för att studera geners funktion och molekylär reglering i NCCs. O9-1 celler olika status kan motsvara olika neural crest avkomma i vivo, beroende på kultur av O9-1 celler. O9-1 celler kan bibehållas i ti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nicole Stancel, Ph.D., ELS, vetenskapliga publikationer på Texas hjärtat Institute, gav redaktionellt stöd. Vi tackar också de följande finansieringskällorna: American Heart Associations nationella Center forskare utveckling Grant (14SDG19840000 till J. Wang), Lawrence forskning Litteraturpriset 2014 från Rolanette och Ehlanas Lawrence ben sjukdom Program i Texas (till J. Wang ), och de National institutionerna of Health (DE026561 och DE025873 till J. Wang, DE016320 och DE019650 till R. Maxson).
Materials
| Active STO feeder cells | ATCC | ATCC CRL-1503 | Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X |
| O9-1 mouse cranial neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | 11960-044 | |
| DMEM, high glucose | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Millipore Sigma | ES-009-B | |
| Penicillin – streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-081 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS | Genesee Scientific | 25-510 | |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium | Lonza | 17-512F | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100X | Gibco | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/ml | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356234 | |
| DMSO (dimethylsulfoxide) | Millipore Sigma | MX1458-6 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| Opti-MEM I (1X) | Gibco | 31985-070 | |
| Minimum essential medium, alpha 1X with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine | Corning | 10-022-CV | |
| ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | Dharmacon | L-041057 | |
| ON-TARGETplus Non-targeting Pool | Dharmacon | D-001810 | |
| ON-TARGETplus Yap1 siRNA | Dharmacon | L-046247 | |
| FCS (fetal calf serum) | |||
| ITS (insulin-transferrin-selenium ) | |||
| TGF-b3 | |||
| Ascorbic acid | |||
| BMP2 (bone morphogenetic protein 2) | |||
| Dexamethasone | |||
| B-27 supplement |
References
- Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
- Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
- Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
- Cordero, D. R., et al. Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development. American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).
- Trainor, P. A. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).
- Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. The neural crest migrating into the twenty-first century. Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).
- Zurkirchen, L., Sommer, L. Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells. Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).
- Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. Induction of the neural crest: a multigene process. Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).
- Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).
- Raible, D. W. Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways. Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Biologie du développement. 366 (1), 83-95 (2012).
- Henion, P. D., Weston, J. A. Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).
- Harris, M. L., Erickson, C. A. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).
- Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages. Development. 130 (2), 321-330 (2003).
- Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. Analysis of early human neural crest development. Biologie du développement. 344 (2), 578-592 (2010).
- Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers. Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Yumoto, K., et al. TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells. Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).
- Wang, J., et al. Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development. Development. 143 (3), 504-515 (2016).
- Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
- Wang, J., Martin, J. F. Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).
- Pan, D. The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).
- Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).
- Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues. Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).
- Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
- Moya, I. M., Halder, G. The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs. Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).
- Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Manderfield, L. J., et al. Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest. Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6, 23208 (2016).
- Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development. International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).
- Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).
- Kang, B. J., et al. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).
- Uemura, M., et al. Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).
