전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징
Summary
여기 이미지 칼슘 murine neuromuscular 접속점에 개별 셀 종류의 인구에 있는 신호 프로토콜 선물이.
Abstract
Electrophysiological 기법에 의해 조직에 있는 세포의 전기적 활동을 모니터링할 수 있습니다 있지만 이들은 일반적으로 개별 셀의 분석을 제한. 셀의 이미징 형광 칼슘-민감한 로드 이후는 cytosol에서 세포내 칼슘 (캘리포니아2 +)의 증가 종종 전기 활동 때문에 발생 합니다 또는 다른 자극의 무수에 응답,이 프로세스에 의해 모니터링 수 있습니다. 염료입니다. 그러나, 그것은이 염료는 조직 내의 모든 세포 유형에 의해 채택 하기 때문에 전체 조직 내에서 개별 셀 형식에서이 응답을 이미지 어렵다. 반면, 유전자 인코딩된 칼슘 지표 (GECIs)는 개별 셀 형식에 의해 표현 될 수 있습니다 및 세포내 캘리포니아2 +, 따라서 허용의 캘리포니아2 + 의 전체 인구에 있는 신호 이미징의 증가에 대 한 응답 형광 개별 셀 종류입니다. 여기, 우리는 마우스 신경 근육 학 교차로 적용할 GECIs GCaMP3/6의 사용, 모터 신경, 골격 근육, 및 터미널/perisynaptic 사이 3 자간 냅 Schwann 세포. 조직 준비 클래식 비보 전 에이 기법의 유틸리티를 설명합니다. 광 스플리터를 사용 하 여, 우리 수행 동적 캘리포니아2 + 신호 듀얼-파장 이미징 및 신경 근육 학 교차로 (NMJ)의 정적 레이블 두 셀 전용 GECI 또는 유전자 인코딩된 전압 모니터링을 쉽게 적용할 수 있는 방법을 지표 (GEVI) 동시에. 마지막으로, 우리는 형광 강도의 공간 지도 캡처하는 데 사용 하는 루틴을 논의. 함께, 이러한 광학, 유전자 변형, 그리고 분석 기술은 공부를 다양 한 문맥에서에서 NMJ에 뚜렷한 세포 모집단의 생물 학적 활동을 사용할 수 있습니다.
Introduction
모든 시 냅 스 처럼 NMJ 3 요소의 구성: 터미널 연 접 신경 postsynaptic 신경/이펙터 셀에서에서 파생 하 고 perisynaptic glial 세포1,2. 시 냅 시스 전송의 기본적인 측면 처음이 시 냅 스3에서 설명 되었다, 하는 동안이 프로세스의 여러 측면,이 시 냅이 스의 고유 셀룰러 요소에 의해 동일한 분자의 표현 때문에 부분에서 알 수 없는 남아 있습니다. 예를 들어 모터 뉴런 척추 NMJ에 의해 공동 출시 되는 퓨 린 아데닌 뉴클레오티드 ATP와 아 세 틸 콜린 (ACh) 수용 체 근육, Schwann 세포, 모터 신경, 따라서 복잡의 해석에 의해 표현 됩니다. 이러한 물질 (예를 들어, 송신기 릴리스 또는 응답, 근육 힘 세대)4에 의해 발휘 하는 기능 효과. 또한,는 NMJ의 같은 구성 요소는 간단한에 비해, 예를 들어 신경 중앙 신경 조직에 여러 개의 시 냅 스 입력, 수시로 전시 하는 모터 신경 세포, 근육 세포, 또는 Schwann 세포 다를 기반으로 하는 자극에 대 한 응답 여부 그들의 내장에 (예를 들어, 배아 파생, 섬유 하위, 형태학)이 명확 하지 않다. 각 이러한 문제를 해결 하기 위해 그것은 동시에 같은 시간, 같은 다른 별도 요소 중 하나에 응답에 트랙 뿐만 아니라 한 시 냅 스 요소 내의 많은 세포의 응답을 추적 하는 것입니다. 칼슘 신호 측정 화학 염료를 사용 하 여 기존의 전략 목욕 적용 염료 조직으로, 신청 후 여러 셀 유형에 의해 채택 되 고 침 로드 염료 시각화에 사용할 수 있기 때문에이 두 가지 목표를 달성할 수 없는 셀의 개인 또는 작은 동료 여기, 휴대 전용 칼슘 신호, 특정 영상 및 소프트웨어 도구5, 우리는이 두 가지 전반적인 목표의 처음을 설명 하 고 토론을 측정 하도록 설계 GECIs를 표현 하는 유전자 변형 쥐를 이용 하 여 어떻게의 새로운 유전자 변형 도구 두 번째 달성 도움이 될. 이 기술은 추적 칼슘 역학 또는 동시에 여러 세포 인구에서 유전자 인코딩 광학 센서를 통해 이벤트 관찰할 신호 다른 세포에 관심이 사람에 대 한 유용할 것 이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기 우리는 측정 캘리포니아2 + 그대로 신경 근육 학 조직 GECI 표현 하는 마우스를 사용 하 여 특정 셀에 응답의 몇 가지 예제를 제공 합니다. 이러한 실험을 성공적으로 수행 하려면 인할지 신경 해 부 동안에 상처를 하지 필수적입니다. 캘리포니아2 + 응답 Schwann 세포 낮은 또는 높은 전력 (즉, 20 X 또는 X 60)에, 이미지를 제너 시스 또는 µ-conotoxin 블록에 사용할 필요가 있다. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 자금 및 연구 자원 5P20RR018751에 대 한 국립 센터 및 국립 연구소의 종합 의료 과학 8 P 20 GM103513 (G.W.H.)에 건강 (NIH) GM103554 및 GM110767 (T.W.G.)에 국립 보건원에서 지원 되었다.
Materials
| Myf5-Cre mice | Jax | #007893 | Drives muscle cell expression as early as E136 |
| Wnt1-Cre mice | Jax | #003829 | Drives expression into all Schwann cells at E13 but not P209 |
| Sox10-Cre mice | Jax | #025807 | Drives Schwann cell expression at older ages |
| Conditional GCaMP3 mice | Jax | #029043 | Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion |
| Conditional GCaMP6f mice | Jax | #024105 | Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion |
| BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one) | Hit2Lead | #5102862 | Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6 |
| CF594-α-BTX | Biotium | #00007 | Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ |
| µ-conotoxin GIIIb | Peptides Int'l | #CONO20-01000 | Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8 |
| Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard | Ellswoth Adhesives | # Sil Dielec Gel .9KG | Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins |
| Minutien pins (0.1mm diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel |
| Eclipse FN1 upright microscope | Nikon | MBA74100 | Allows staging and observation of specimen |
| Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator | Autom8 | MXMScr | Allows movement of specimen |
| Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | Holds recording and stimulating electrodes |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Axoclamp 900A | Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording |
| Microelectrode low-noise data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1550 | Allows electrophysiological data acquisition |
| Microelectrode data analysis system | Molecular Devices | PCLAMP 10 Standard | Performs electrophysiological data analysis |
| Square wave stimulator | Grass | S48 | Stimulates nerve to excite muscle |
| Stimulus Isolation Unit | Grass | PSIU6 | Reduces stimulation artifacts |
| Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter | Sutter | FG-GBF100-50-15 | Impales and records nerve-evoked muscle potentials |
| Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter | Sutter | BF150-117-15 | Lengthened and used for suction electrode |
| Micropipette Puller | Sutter | P-97 | Pulls and prepares recording electrodes |
| 1200×1200 pixel, back-illuminated cMOS camera | Photometrics | Prime 95b | Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging |
| Light Source | Lumencor | Spectra X | Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation |
| Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm | Nikon | CFI60 | Provide long working distances for visualization of specimen |
| Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp | Sumita | LS-DWL-N | Provides illumination for brightfield observation |
| W-View Gemini Image Splitter | Hamamatsu | A12801-01 | Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera |
| Single-band Bandpass Filters (512/25-25 and 630/92-25) | SemRock | FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 | Permits dual band imaging |
| 560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter | Sem Rock | FF560-FDi01-25×36 | Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging |
| Imaging data acquisition system | Nikon | NIS Elements – MQS31000 | Allows imaging data acquisition |
| Wavelength control module | Nikon | MQS41220 | Module for imaging data acqusiition |
| Emission splitter hardware module | Nikon | MQS41410 | Module for imaging data acqusiition |
| Imaging data analysis system | NA | Volumetry 8D5, Fiji | Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data |
References
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