Ex Vivo Proyección de imagen del calcio celular específicos de señalización en la sinapsis tripartita del diafragma del ratón
Summary
Aquí presentamos un protocolo de calcio imagen señalización en poblaciones individuales de tipos de células en la Unión neuromuscular murino.
Abstract
La actividad eléctrica de las células en los tejidos puede ser monitoreada por técnicas electrofisiológicas, pero éstos se limitan generalmente para el análisis de células individuales. Ya que un aumento del calcio intracelular (Ca2 +) en el citosol ocurre a menudo debido a la actividad eléctrica, o en respuesta a una multitud de otros estímulos, este proceso puede ser monitoreado por la proyección de imagen de células cargadas con fluorescente sensible al calcio colorantes. Sin embargo, es difícil esta respuesta en un tipo de células individuales dentro del tejido de todo la imagen porque estos tintes son tomados por todos los tipos de células dentro del tejido. En cambio, los indicadores genético codificados calcio (GECIs) pueden expresarse mediante un tipo de célula individual y fluorescencia en respuesta a un aumento de intracelular Ca2 +, lo que permite la proyección de imagen de Ca2 + en poblaciones enteras de tipos de células individuales. Aquí aplicamos el uso de GECIs GCaMP3/6 a la Unión neuromuscular de ratón, células de Schwann de sinapsis entre las neuronas motoras, el músculo esquelético y terminal/perisynaptic tripartita. Demostramos la utilidad de esta técnica en preparaciones de tejido clásico ex vivo . El uso de un divisor óptico, realizar proyección de imagen de doble longitud de onda de Ca2 + señales de dinámica y estática etiqueta de la placa neuromuscular (NMJ) en un enfoque que podría ser fácilmente adaptado para monitorear dos GECI específicos de la célula o voltaje genéticamente codificado indicadores (GEVI) simultáneamente. Finalmente, discutimos las rutinas que utilizan para capturar mapas espaciales de intensidad de fluorescencia. Juntos, pueden emplearse estas técnicas ópticas, transgénicos y analíticas para el estudio de la actividad biológica de las subpoblaciones de células distintas en el NMJ en una amplia variedad de contextos.
Introduction
El NMJ, como todas las sinapsis, se compone de tres elementos: una terminal presináptica deriva de una neurona, una célula postsynaptic neurona/efector, y un perisynaptic glial de la célula1,2. Mientras que los aspectos básicos de la transmisión sináptica se demostraron por primera vez en esta sinapsis3, muchos aspectos de este proceso siguen siendo desconocidos, en parte debido a la expresión de las moléculas del mismo por los distintos elementos celulares de esta sinapsis. Por ejemplo, se expresan receptores para acetilcolina (ACh) tanto el nucleótido de purina adenina ATP que conjuntamente son liberados por las neuronas motoras en lo vertebrado NMJ, músculo, células de Schwann y las neuronas motoras, así que complica la interpretación de cualquier efecto funcional ejercida por estas sustancias (p. ej., liberación de transmisor o respuesta, generación de fuerza muscular)4. Por otra parte, aunque los componentes tripartitos de la NMJ son simples en comparación con, por ejemplo, las neuronas en el sistema nervioso central que a menudo exhiben múltiples entradas sinápticas, si las neuronas motoras, las células musculares o las células de Schwann varían en respuesta a estímulos en en su intrínseca heterogeneidad (p. ej., derivación embrionaria, subtipo de fibra, morfología) es confuso. Para abordar cada uno de estos temas, sería ventajoso seguir simultáneamente la respuesta de muchas células dentro de un elemento sináptica, como pista, a la vez, una respuesta en cualquiera de los otros elementos. Estrategias convencionales utilizando colorantes químicos para medir calcio señalización no pueden alcanzar estos dos objetivos, porque aplicar baño de tinte es tomado por varios tipos de la célula después de la aplicación al tejido, y tinte intracelular cargado puede utilizarse para visualizar individuales o pequeñas cohortes de las células. Aquí, utilizando ratones transgénicos que expresaban GECIs diseñado para medir calcio celular específico señalización, junto con la proyección de imagen específica y herramientas de software5, que demostrar la primera de estas dos metas generales y discutir cómo la adición de nuevos herramientas de transgénicos ayudaría a alcanzar al segundo. Esta técnica será útil para cualquier persona interesada en el seguimiento de la dinámica del calcio u otro celular señalización observable de eventos a través de sensores ópticos codificada por el gen en varias poblaciones de la célula al mismo tiempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí le ofrecemos algunos ejemplos de medición de Ca2 + respuestas en células específicas en tejido neuromuscular intacto usando ratones expresan GECI. Para realizar exitosamente estos experimentos, es imperativo de no lesionar el nervio frénico durante la disección. Para imagen de Ca2 + respuestas en las células de Schwann en baja o alta energía (es decir, 20 X o 60 X), es necesario utilizar BHC o μ-Conotoxina al movimiento del bloque. Para la proyección de imagen de baja potenci…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado con fondos de los institutos nacionales de salud (NIH) GM103554 y GM110767 a (T.W.G.) y del centro nacional para recursos de investigación 5P20RR018751 y el Instituto Nacional de Ciencias de médicas General 8P 20 GM103513 (a G.W.H.).
Materials
| Myf5-Cre mice | Jax | #007893 | Drives muscle cell expression as early as E136 |
| Wnt1-Cre mice | Jax | #003829 | Drives expression into all Schwann cells at E13 but not P209 |
| Sox10-Cre mice | Jax | #025807 | Drives Schwann cell expression at older ages |
| Conditional GCaMP3 mice | Jax | #029043 | Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion |
| Conditional GCaMP6f mice | Jax | #024105 | Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion |
| BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one) | Hit2Lead | #5102862 | Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6 |
| CF594-α-BTX | Biotium | #00007 | Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ |
| µ-conotoxin GIIIb | Peptides Int'l | #CONO20-01000 | Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8 |
| Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard | Ellswoth Adhesives | # Sil Dielec Gel .9KG | Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins |
| Minutien pins (0.1mm diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel |
| Eclipse FN1 upright microscope | Nikon | MBA74100 | Allows staging and observation of specimen |
| Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator | Autom8 | MXMScr | Allows movement of specimen |
| Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | Holds recording and stimulating electrodes |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Axoclamp 900A | Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording |
| Microelectrode low-noise data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1550 | Allows electrophysiological data acquisition |
| Microelectrode data analysis system | Molecular Devices | PCLAMP 10 Standard | Performs electrophysiological data analysis |
| Square wave stimulator | Grass | S48 | Stimulates nerve to excite muscle |
| Stimulus Isolation Unit | Grass | PSIU6 | Reduces stimulation artifacts |
| Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter | Sutter | FG-GBF100-50-15 | Impales and records nerve-evoked muscle potentials |
| Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter | Sutter | BF150-117-15 | Lengthened and used for suction electrode |
| Micropipette Puller | Sutter | P-97 | Pulls and prepares recording electrodes |
| 1200×1200 pixel, back-illuminated cMOS camera | Photometrics | Prime 95b | Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging |
| Light Source | Lumencor | Spectra X | Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation |
| Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm | Nikon | CFI60 | Provide long working distances for visualization of specimen |
| Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp | Sumita | LS-DWL-N | Provides illumination for brightfield observation |
| W-View Gemini Image Splitter | Hamamatsu | A12801-01 | Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera |
| Single-band Bandpass Filters (512/25-25 and 630/92-25) | SemRock | FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 | Permits dual band imaging |
| 560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter | Sem Rock | FF560-FDi01-25×36 | Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging |
| Imaging data acquisition system | Nikon | NIS Elements – MQS31000 | Allows imaging data acquisition |
| Wavelength control module | Nikon | MQS41220 | Module for imaging data acqusiition |
| Emission splitter hardware module | Nikon | MQS41410 | Module for imaging data acqusiition |
| Imaging data analysis system | NA | Volumetry 8D5, Fiji | Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).
- Fatt, P., Katz, B. An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode. Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).
- Todd, K. J., Robitaille, R. Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction. Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).
- Hennig, G. W., et al. Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon. Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).
- Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology. Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).
- Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).
- Hong, S. J., Chang, C. C. Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse. British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).
- Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue. Elife. 7, e30839 (2018).
- Cho, J. H., et al. The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
