Här presenterar vi ett protokoll för live-imaging av fluorescently märkt mänskliga livmodercancer fragment ympas in möss. Metoden gör det möjligt att studera effekterna av droger val på endometriotic lesionsstorlek genom övervakning och kvantifiering av fluorescens som avges av fluorescerande reportern på realtid
Här beskriver vi ett protokoll för genomförandet av ett heterologt musmodell där progression av endometrios kan bedömas i realtid genom icke-invasiv övervakning av fluorescens som avges av implanterade ektopisk mänsklig livmodercancer vävnad. För detta ändamål erhålls biopsier av mänskliga endometriet från givare kvinnor pågående äggcellen donation. Mänskliga livmodercancer fragment är odlade i närvaro av adenoviruses konstruerad att uttryckliga cDNA för den reporter fluorescerande protein mCherry. Vid visualisering, märkt vävnader med en optimal frekvens av fluorescens efter infektion väljs därefter för implantation i mottagarens möss. En vecka före implantation kirurgi, mottagarens möss är oophorectomized och estradiol pellets placeras subkutant för att upprätthålla överlevnad och tillväxt av lesioner. På operationsdagen är möss sövda och peritoneal hålighet nås genom en liten (1,5 cm) snitt av linea-alba. Fluorescently märkta implantat är tweezed, kortfattat indränkt i lim och bifogas peritoneal lagret. Snitt är sys, och djur kvar för att återvinna för ett par dagar. Fluorescens som avges av endometriotic implantat är oftast icke-invasivt övervakas varje 3 dagar i 4 veckor med ett in vivo imaging system. Variationer i storlek av endometriotic implantat kan beräknas i realtid genom kvantifiering av mCherry signal och normalisering mot den första tidpunkt visar maximal fluorescensintensiteten.
Traditionella prekliniska gnagare modeller av endometrios tillåter inte icke-invasiv övervakning av lesion i realtid men snarare möjliggöra utvärdering av effekterna av narkotika analyseras vid slutpunkten. Detta protokoll gör att man kan spåra lesioner i realtid och är mer användbar för att undersöka den terapeutiska potentialen av droger i prekliniska modeller av endometrios. Den största begränsningen av frigjorda-modellen är att icke-invasiv övervakning inte är möjligt under en längre tid på grund av ett episomal uttryck för Ad-virus.
Endometrios är en kronisk gynekologisk sjukdom som initierats av implantation av funktionella livmoderslemhinnan utanför livmoderhålan. Ektopisk lesioner växer och inducerar inflammatoriska processer som leder till kronisk bäcken smärta och infertilitet1. Det uppskattas att upp till 10 – 15% av kvinnor i fertil ålder är drabbade av endometriosis2, och det är närvarande i cirka 40 – 50% av infertila kvinnor3. Aktuella farmakologiska behandlingar för endometrios är inte att helt utrota lesioner och inte fria från biverkningar4,5. Forskning för effektivare terapier kräver av förfiningen av de befintliga djurmodeller av endometrios på ett sådant sätt att människors lesioner kan vara lämpligt härmade och effekterna av föreningar på lesionsstorlek bland annat kan bedömas noggrant.
Primate modeller har använts för att efterlikna endometrios genom att implantera ektopisk lesioner histologiskt identiska och på liknande platser som människor6,7,8. dock relaterade etiska betänkligheter och de höga ekonomiska kostnaderna till experiment med primater gräns deras användning9. Följaktligen, användning av små djur, speciellt gnagare, för genomförandet av in vivo-modeller av endometrios fortsätter att vara gynnad eftersom det tillåter studier med större antal individer10,11. Endometrios kan induceras hos dessa djur av omplantering antingen bitar av gnagare livmoderns horn (”homologa modeller”)12,13 eller mänsklig endometriehyperplasi/endometriotic vävnad till ektopisk webbplatser (heterologa modeller)14 . I motsats till människor, gnagare utgjuta inte deras livmodercancer vävnad och därmed endometrios kan inte utvecklas spontant i dessa arter. Homologa mus modeller av endometrios har kritiserats på grund av att implanteras ektopisk mus uterin vävnad avspeglar därför inte kännetecknen av mänskliga endometriotic lesioner15.
Lämpliga fysiologi endometrios kan vara härmade i heterologa modeller av endometrios där färska mänskliga livmodercancer fragment implanteras i nedsatt immunförsvar djur. I konventionella heterologa modeller bedöms de terapeutiska effekterna av föreningar av intresse vanligen vid slutpunkten av bedömningen av mållesionens storlek med hjälp av bromsok16. En uppenbar begränsning är att, som sådan, endpoint djurmodeller inte tillåter studerar implantation dynamics eller endometriotic lesion utveckling över tid. En ytterligare begränsning är att användningen av bromsok inte tillåter noggranna mätningar av mållesionens storlek. Standardfel som tillhandahålls av bromsok är faktiskt i samma intervall (dvs millimeter) i samma storlek som de lesioner som implanteras i möss, vilket begränsar kapaciteten av dessa verktyg att upptäcka faktiska variationer i storlek.
För att övervinna sådana begränsningar, beskriver vi häri, generering av ett heterologt musmodell av endometrios där implanterade mänsklig vävnad är konstruerad för att uttrycka en reporter m-Cherry fluorescerande protein. Påvisande av fluorescerande signalen med en lämplig bild system möjliggör icke-invasiv övervakning av lesion status med samtidiga kvantifiering av dess storlek i realtid. Vår modell ger således tydliga fördelar jämfört med konventionella endpoint modeller eftersom det ger möjlighet för icke-invasiv övervakning i realtid och möjligheten att utföra mer objektiva och korrekt uppskattning av variationer i lesionsstorlek.
Protokollet beskrivs häri beskriver genomförandet av en djurmodell av endometrios där arkitekturen att implantera lesioner arkitekturen är bevarad medan samtidigt tillåter realtid bedömning av fluorescens som avges av mCherry märkt livmodercancer vävnad. I detta protokoll beskriver vi användning av en specifik i vivo imaging system och tillhörande programvara att bedöma icke-invasivt fluorescens som avges av märkt lesionen. Varje användare bör anpassa protokollet beroende på specifika bildenhet och relater…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av spanska ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft genom Miguel Servet Program [CP13/00077] tillsammans grundade av ERUF (Europeiska regionalutvecklingsfonden) och tilldelas till Dr R. Gómez samt av Carlos III Institute of Health bidrag att Dr R Gómez [PI14/00547 och PI17/02329] och Prof A. Cano [PI12/02582].
Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
Syringes, medical 10 ml 0,5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | — | In vivo monitoring software |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
Isovet 1000 mg/g | B-BRAUN | — | Isoflurane (Anesthetic) |
Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | — | Buprenorphine (Analgesic solution) |
Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | — | Morphine (Analgesic solution) |
Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | — | Sutures |
Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | — | Antiseptic solution |
Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | — | fluorescence microscope |
Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |