Cystein-rige peptider fold i særskilte tredimensionale strukturer afhængigt af deres disulfid connectivity. Målrettet syntese af individuelle disulfid isomerer er påkrævet, når buffer oxidation ikke fører til den ønskede disulfid connectivity. Protokollen beskæftiger sig med den selektive syntese af 3-disulfid-bonded peptider og deres strukturelle analyse ved hjælp af NMR- og MS/MS undersøgelser.
Peptider med et stort antal cysteines påvirkes normalt med tre-dimensionelle struktur af deres disulfid connectivity. Det er således meget vigtigt at undgå uønskede disulfid obligation dannelse under faststadie peptidsyntese, fordi det kan resultere i en helt anden peptid struktur, og derfor ændrede bioactivity. Den korrekte dannelsen af flere disulfid obligationer i et peptid er imidlertid vanskelig at opnå ved hjælp af standard selv folde metoder såsom konventionelle buffer oxidation protokoller, fordi flere disulfid connectivities kan dannes. Denne protokol udgør en avanceret strategi kræves for målrettede syntese af flere disulfid bro peptider, der ikke kan syntetiseres via buffer oxidation i høj kvalitet og mængde. Undersøgelsen viser anvendelsen af en særskilt beskytte gruppe strategi for syntesen af alle mulige 3 disulfid-bundne peptid isomerer af µ-conotoxin PIIIA i en målrettet måde. Peptider er udarbejdet af Fmoc-baseret solid fase peptidsyntese ved hjælp af en beskyttelse gruppe strategi for definerede disulfid obligation dannelse. De respektive par af cysteines er beskyttet med trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) og tert-butyl (tBu) beskytte grupper for at sikre, at kun de nødvendige cysteines under hver oxidation skridt er deprotected og forbundet. Ud over de målrettede syntese anvendes en kombination af flere analytiske metoder til at afklare de korrekte folding og generation af de ønskede peptid strukturer. Sammenligning af forskellige 3-disulfid-bonded isomerer angiver betydningen af nøjagtig bestemmelse og viden om disulfid tilslutningsmuligheder for beregningen af den tre-dimensionelle struktur og fortolkning af biologiske aktivitet af peptid isomerer. Den analytiske karakterisering indeholder nøjagtige disulfid obligation udredning via tandem massespektrometri (MS/MS) analyse, som er udført med delvist reduceret og alkylerede derivater af intakt peptid isomer produceret af en tilpasset protokol. Derudover fastlægges peptid strukturer ved hjælp af 2D Kernemagnetisk resonans (NMR) eksperimenter og viden indhentet fra MS/MS analyse.
Brugen af bioaktive peptider i farmaceutisk forskning og udvikling er meget anerkendt, fordi de repræsenterer potent og yderst selektiv forbindelser for specifikke biologiske mål1. For deres bioactivity, men er de tre-dimensionelle struktur af stor betydning for at kunne udføre struktur-aktivitet relationer undersøgelser2,3,4. Ud over den primære aminosyresekvens der påvirker den generelle kropsbygning, stabilisere disulfid obligationer betydeligt strukturen af cystein-rige peptider5. Flere disulfid bro peptider omfatter conotoxins som µ-PIIIA fra Conus purpurascens som indeholder seks cysteines i dens sekvens. Denne høje cystein indhold teoretisk tillader dannelsen af 15 disulfid isomerer. Den korrekte disulfid connectivity er meget vigtigt, at den biologiske aktivitet6,7. Men spørgsmålet er, om der er mere end én bioaktive kropsbygning af naturligt forekommende peptider og hvis så, hvilke af disse isomerer besidder den højeste biologiske aktivitet? I forbindelse med µ-conotoxins, de biologiske mål spænding-gated natrium Ionkanaler, og µ-PIIIA især er mest potente for undertyper NaV1.2, NaV1,4 og NaV1.73.
Syntesen af disulfid bro peptider kan opnås ved hjælp af forskellige metoder. Den mest bekvemme metode til dannelsen af svovlbroer inden for et peptid er den såkaldte oxidative selvstændige folde tilgang. Her, er den lineære forløber for den ønskede cyklisk peptid syntetiseret, først ved hjælp af solid faststadie peptidsyntese, som kommer efter spaltning af polymert støtte udsat for oxidation i en buffersystem. Redox-aktive stoffer såsom reduceret og oxideret glutathion (GSH/GSSG) tilsættes ofte til at fremme dannelsen af disulfid obligationer. Den største ulempe ved buffer-støttede selvstændige folde er at disulfid obligationer ikke er dannet selektivt i en trinvis måde. I forhold til den indfødte peptid, som ofte kun én specifik disulfid isomer er beskrevet, er det muligt at opnå talrige andre isomere med denne tilgang til8. µ-PIIIA har allerede vist sig at resultere i mindst tre anderledes foldede isomerer ved selvstændig foldning i et tidligere studie3. Adskillelse af sådan en isomer blanding er temmelig vanskelig på grund af lignende retentionstider anvender chromatografiske rensning metoder9. Den målrettede syntese af en bestemt isomer er derfor fordelagtige. Til specifikt producere en isomer med definerede disulfid connectivity, en særlig strategi kræves som disulfid obligationer er successivt lukket. Derfor, den lineære forløber transporterer særskilt beskytte grupper på de enkelte cystein par er syntetiseret i polymer støtte. Efter eliminering, cystein par er individuelt og successivt deprotected og knyttet en oxidation reaktion til at give den ønskede disulfid obligationer10,11,12,13, 14 , 15 , 16. efter syntese og rensning af reaktionsprodukt, er det nødvendigt at bekræfte identitet og disulfid tilslutning af egnede analysemetoder. Findes mange analytiske metoder til udredning af den primære aminosyresekvens, fx., MS/MS, mens fastsættelsen af disulfid connectivity er stadig langt mindre undersøgte. Ud over kompleksiteten af sådanne flere disulfid-bonded peptider, produkt-relaterede urenheder (fx., fra disulfid scrambling), på grund af prøve forberedelse og arbejde op kan yderligere komplicere analyse. I dette papir viser vi, at brugen af en kombination af forskellige analytiske teknikker er nødvendigt at utvetydigt tydeliggøre identiteten af disulfidbroer i µ-PIIIA isomerer. Vi har kombineret kromatografiske metoder med massespektrometri og leveres de samme prøver at NMR spektroskopi. I matrix assisted laser desorption/ionization(MALDI) MS/MS analyse identificeret vi disulfid obligationer ved hjælp af delvis reduktion og iodoacetamide forædling fordi top-down analyse ikke er muligt for dette peptid. 2D NMR eksperimenter blev udført for at opnå en tredimensionel struktur af hver isomer. Ved at kombinere forskellige avancerede analytiske metoder, er det således muligt at belyse korrekt disulfid connectivity og tre-dimensionelle struktur af komplekse flere disulfid-bonded peptider7.
Den metode beskrevet heri for syntesen af cystein-rige peptider som µ-PIIIA repræsenterer en mulighed for at producere selektivt disulfid-bonded isomerer fra den samme aminosyresekvens. Derfor etablerede metoder såsom Fmoc-baseret solid fase peptid syntese18 og en defineret beskytte gruppe strategi for regioselective dannelsen af svovlbroer blev brugt16. Solid faststadie peptidsyntese kan producere aminosyresekvenser på en polymer støtten (harpiks) via automatiseret sy…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke A. Resemann, F. J. Mayer og D. Suckau fra Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts og C. Thiele fra Darmstadt University of Technology; O. Ohlenschläger fra FLI Jena, M. Engeser fra universitetet i Bonn; K. Kramer, A. Harzen og H. Nakagami fra Max Planck Institute for Breeding planteforskning, Köln; Susanne Neupert fra Institut for zoologi, Köln; og biomolekylær Kernemagnetisk resonans-spektroskopi faciliteter af universitetet i Frankfurt for teknisk støtte, uddannelsesmoduler, samt adgang til instrumenter. Finansiel støtte ved universitetet i Bonn til di erkendes taknemmeligt.
Fmoc Rink amide resin | Novabiochem | 855001 | |
Pyr(Boc) | Bachem | A-3850 | |
Arg(Pbf) | Iris Biotech | FSC1010 | |
Asn(Trt) | Bachem | B-1785 | |
Asp(tBu) | Iris Biotech | FSP1020 | |
Hyp(tBu) | Iris Biotech | FAA1627 | |
Lys(Boc) | Bachem | B-1080 | |
Ser(tBu) | Iris Biotech | FSC1190 | |
Gln(Trt) | Iris Biotech | FSC1043 | |
Glu(tBu) | Iris Biotech | FSP1045 | |
Trp(Boc) | Iris Biotech | FSC1225 | |
Tyr(tBu) | Sigma Aldrich | 47623 | |
Thr(tBu) | Iris Biotech | FSP1210 | |
His(Trt) | Iris Biotech | FDP1200 | |
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat | Sigma Aldrich | 8510060 | Flammable |
DMF | Fisher Scientific | D119 | Flammable, Toxic |
DCM | Fisher Scientific | D37 | Carcinogenic |
Piperidine | Alfa Aesar | A12442 | Flammable, Toxic, Corrosive |
N-Methyl-Morpholin | Sigma Aldrich | 224286 | |
Cys(Acm) | Iris Biotech | FAA1506 | |
Cys(Trt) | Bachem | E-2495 | |
Cys(tBu) | Bachem | B-1220 | |
trifluoruacetic acid | Sigma Aldrich | 74564 | Toxic, Corrosive |
phenol | Merck | 1002060 | Toxic |
thioanisol | Alfa Aesar | A14846 | |
ethanedithiol | Fluka Analytical | 2390 | |
diethyl ether | VWR | 100,921 | Flammable |
tert-butanol | Alfa Aesar | L12338 | Flammable |
acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | Flammable |
water | Fisher Scientific | W5 | |
isopropanol | VWR | ACRO42383 | Flammable |
sodium hydroxide | AppliChem | A6579,1000 | Corrosive |
iodoacetamide | Sigma Aldrich | I6125 | |
iodine | Sigma Aldrich | I0385 | |
Hydrochloric acid | Merck | 110165 | Corrosive |
ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
diphenylsulfoxide | Sigma Aldrich | P35405 | |
anisol | Sigma Aldrich | 96109 | Flammable |
trichloromethylsilane | Sigma Aldrich | M85301 | Flammable |
sample dilution buffer | Laborservice Onken | ||
sodium dihydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 106370 | |
disodium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | |
(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
citric acid | Sigma Aldrich | 251275 | |
sodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | W302600 | |
tris-acetate | Carl Roth, | 7125 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E26282 | |
peptide calibration standard II | Bruker Daltonics GmbH | 8222570 | |
Name of Equipment | Company | ||
solid-phase peptide synthesizer | Intavis Bioanalytical Instruments AG | EPS 221 | |
lyophilizer | Martin Christ GmbH | Alpha 1-2 Ldplus | |
semipreparative HPLC | Jasco | system PV-987 | |
Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) | Knauer | 25QE181E2J | purification of the linear peptide |
Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP1022 | purification of the oxidized peptide |
analytical HPLC | Shimadzu | system LC-20AD | |
Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP54 | analytical column |
ground steel target (MTP 384) | Bruker Daltonics GmbH | NC0910436 | MALDI preparation |
C18-concentration filter (ZipTip) | Merck KGaA | ZTC18S096 | MALDI preparation |
MALDI mass spectrometer | Bruker Daltonics GmbH | ultraflex III TOF/TOF | |
amino acid analyzer | Eppendorf-Biotronik GmbH | LC 3000 system | |
NMR spectrometer Bruker Avance III | Bruker Daltonics GmbH | Bruker Avance III 600 MHz | |
computer program for molecular visualising | YASARA Biosciences GmbH | Yasara structures | NMR structure calculation |
computer program for MALDI data evaluation | Bruker Daltonics GmbH | flexAnalysis, BioTools | MS/MS fragmentation |
analog vortex mixer | VWR | VM 3000 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5410 | |
Centrifuge | Hettich | EBA 20 | |
Rotational vacuum concentrator | Christ | 2-18 Cdplus | |
Analytical Balance | A&D Instruments | GR-202-EC |