Sintesi e determinazione della struttura di µ-conotossina PIIIA isomeri con bisolfuro diverse connettività
Summary
Ricche di cisteina peptidi piegare in strutture tridimensionali distinte a seconda della loro connettività di bisolfuro. Sintesi mirata di isomeri di bisolfuro individuali sono necessaria quando ossidazione buffer non comporta la connettività di bisolfuro desiderata. Il protocollo riguarda la sintesi selettiva dei peptidi 3-bisolfuro-legato e loro analisi strutturale mediante studi NMR e MS/MS.
Abstract
Peptidi con un elevato numero di cisteine sono influenzati solitamente per quanto riguarda la struttura tridimensionale di loro connettività di bisolfuro. Così è molto importante per evitare la formazione di legami disolfuro indesiderati durante la sintesi del peptide, perché può provocare una struttura completamente diversa del peptide e alterato di conseguenza bioattività. Tuttavia, la corretta formazione di ponti disolfuro multiple in un peptide è difficile da ottenere utilizzando metodi di auto-pieghevoli standard quali i protocolli di ossidazione convenzionale buffer, perché diverse connettività disolfuro può essere formato. Questo protocollo rappresenta una strategia avanzata necessaria per la sintesi mirata di più peptidi a ponte disolfuro che non possono essere sintetizzati tramite ossidazione di buffer in alta qualità e quantità. Lo studio dimostra l’applicazione di una strategia di gruppo protezione distinte per la sintesi di tutti gli isomeri possibili peptide 3-bisolfuro-legato di µ-conotossina PIIIA in modo mirato. I peptidi sono preparati di sintesi del peptide di fase solida Fmoc-based utilizzando una strategia di gruppo protezione per formazione di legami disolfuro definiti. Le rispettive coppie di cisteine sono protetti con trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) e tert-butilico (tBu) proteggere gruppi per assicurarsi che in ogni fase di ossidazione solo le cisteine richieste sono deprotetti e collegate. Oltre la sintesi mirata, una combinazione di diversi metodi analitici è utilizzata per chiarire il corretto folding e la generazione delle strutture del peptide desiderato. Indica il confronto tra i diversi isomeri 3-bisolfuro-legato l’importanza della determinazione accurata e conoscenza della connettività disolfuro per il calcolo della struttura tridimensionale e interpretazione del biologico attività degli isomeri del peptide. La caratterizzazione analitica comprende la delucidazione di legame disolfuro esatta tramite analisi di spettrometria di massa (MS/MS) tandem che viene eseguita con derivati parzialmente ridotti e alchilati di isomero peptide intatto prodotto da un protocollo adattato. Inoltre, le strutture del peptide sono determinate utilizzando esperimenti 2D a risonanza magnetica nucleare (NMR) e le conoscenze ottenute da analisi MS/MS.
Introduction
L’uso di peptidi bioattivi in farmaceutica ricerca e sviluppo è altamente riconosciuta, perché essi rappresentano composti potente e altamente selettivi per specifici bersagli biologici1. Per loro bioattività, tuttavia, la struttura tridimensionale è di grande importanza al fine di eseguire il rapporto struttura-attività studi2,3,4. A parte la sequenza di amminoacido primaria che influenza la conformazione generale, legami bisolfurico significativamente stabilizzano la struttura dei peptidi ricchi di cisteina5. Più peptidi a ponte disolfuro includono conotossine come µ-PIIIA da Conus purpurascens che contiene sei cisteine nella relativa sequenza. Questo contenuto di cisteina alta teoricamente permette la formazione di 15 isomeri di bisolfuro. La connettività di bisolfuro corretta è molto importante per l’attività biologica6,7. Tuttavia, la domanda che si pone è se c’è più di una conformazione bioattiva di peptidi naturali e se così, quale di questi isomeri possiede il più alta attività biologica? Nel caso di µ-conotossine, i bersagli biologici sono canali ionici voltaggio-dipendenti del sodio e µ-PIIIA, in particolare, è più potente per sottotipi NaV1.2, NaV1.4 e NaV1.73.
Sintesi di peptidi a ponte disolfuro può essere raggiunto utilizzando vari metodi. Il metodo più conveniente per la formazione di ponti disolfuro all’interno di un peptide è il cosiddetto approccio auto-folding ossidativo. Qui, il lineare precursore del peptide ciclico desiderato è sintetizzato utilizzando prima sintesi del peptide di fase solida, che è dopo la scissione dal supporto polimerico sottoposto ad ossidazione in un sistema tampone. Agenti redox-attivo come glutatione ridotto e ossidato (GSH/GSSG) vengono spesso aggiunti per promuovere la formazione dei legami disolfuro. Lo svantaggio principale di auto-buffer-supportato pieghevoli è che i legami disolfuro non si formano in modo selettivo ad un modo graduale. Rispetto al peptide nativo, per cui spesso isomero di un solo specifico disolfuro è descritto, è possibile ottenere numerosi altri isomeri con questo approccio8. µ-PIIIA ha già dimostrato di provocare almeno tre isomeri diversamente piegati su self-pieghevole in un precedente studio3. La separazione di una miscela di isomeri è piuttosto difficile a causa di tempi di ritenzione simili se utilizza metodi di purificazione cromatografica9. La sintesi mirata di un isomero specifico è pertanto vantaggiosa. A specificamente producono che un isomero con connettività di bisolfuro definiti, una strategia speciale è necessaria in cui obbligazioni al bisolfuro successivamente vengono chiusi. Pertanto, il precursore lineare che trasportano gruppi distinti di protezione presso le coppie singoli cisteina è sintetizzato il supporto di polimero. Dopo l’eliminazione, le coppie di cisteina sono individualmente e successivamente deprotetti e collegati in una reazione di ossidazione per produrre il desiderato bisolfuro obbligazioni10,11,12,13, 14 , 15 , 16. dopo la sintesi e la purificazione del prodotto di reazione, è necessario confermare l’identità e la connettività di bisolfuro di metodi analitici adatti. Numerosi metodi analitici sono disponibili per la delucidazione della sequenza primaria dell’amminoacido, ad es., MS/MS, mentre la determinazione della connettività bisolfuro rimane ancora molto meno studiata. A parte la complessità di tali peptidi multipli di bisolfuro-legato, impurità relative ai prodotti (ad es., da bisolfuro scrambling), a causa del campione preparazione e work-up può complicare ulteriormente analisi. In questa carta, indichiamo che l’uso di una combinazione di diverse tecniche analitiche è necessario chiarire in modo inequivocabile l’identità dei legami disolfuro negli isomeri µ-PIIIA. Abbiamo combinato i metodi cromatografici con spettrometria di massa e fornito gli stessi campioni di spettroscopia NMR. In matrix-assisted laser desorption/ionization(MALDI) analisi MS/MS, abbiamo identificato i legami disolfuro con riduzione parziale e iodoacetamide derivatizzazione in quanto analisi top-down non sono possibile per questo peptide. 2D NMR esperimenti sono stati eseguiti al fine di ottenere una struttura tridimensionale di ogni isomero. Così, combinando metodi analitici sofisticati distinti, è possibile chiarire correttamente la connettività di bisolfuro e la struttura tridimensionale del complesso più peptidi bisolfuro-legato7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo descritto nel presente documento per la sintesi di peptidi ricchi di cisteina come µ-PIIIA rappresenta una possibilità di produrre in modo selettivo gli isomeri bisolfuro-legato dalla stessa sequenza dell’amminoacido. Di conseguenza, stabilire metodi come solida base di Fmoc fase peptide sintesi18 e una strategia di gruppo protezione definita per la formazione regioselettiva di legami bisolfurico erano usati16. La sintesi peptidica in fase solida può produrre s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare r. Resemann, F. J. Mayer e D. Suckau da Bruker Daltonics GmbH di Brema; D. Tietze, r. r. Tietze, V. Schmidts e C. Thiele dal Politecnico di Darmstadt; O. Ohlenschläger dal FLI Jena, M. Engeser all’Università di Bonn; K. Kramer, r. Vortrieb e H. Nakagami dal Max Planck Institute for Plant Breeding Research, Colonia; Susanne Neupert dell’Istituto di zoologia, Colonia; e le strutture di spettroscopia di risonanza magnetica biomolecolari dell’Università di Francoforte per tecnico sostegno, moduli, di formazione e accesso agli strumenti. Sostegno finanziario all’Università di Bonn a D.I. si ringraziano.
Materials
| Fmoc Rink amide resin | Novabiochem | 855001 | |
| Pyr(Boc) | Bachem | A-3850 | |
| Arg(Pbf) | Iris Biotech | FSC1010 | |
| Asn(Trt) | Bachem | B-1785 | |
| Asp(tBu) | Iris Biotech | FSP1020 | |
| Hyp(tBu) | Iris Biotech | FAA1627 | |
| Lys(Boc) | Bachem | B-1080 | |
| Ser(tBu) | Iris Biotech | FSC1190 | |
| Gln(Trt) | Iris Biotech | FSC1043 | |
| Glu(tBu) | Iris Biotech | FSP1045 | |
| Trp(Boc) | Iris Biotech | FSC1225 | |
| Tyr(tBu) | Sigma Aldrich | 47623 | |
| Thr(tBu) | Iris Biotech | FSP1210 | |
| His(Trt) | Iris Biotech | FDP1200 | |
| 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat | Sigma Aldrich | 8510060 | Flammable |
| DMF | Fisher Scientific | D119 | Flammable, Toxic |
| DCM | Fisher Scientific | D37 | Carcinogenic |
| Piperidine | Alfa Aesar | A12442 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| N-Methyl-Morpholin | Sigma Aldrich | 224286 | |
| Cys(Acm) | Iris Biotech | FAA1506 | |
| Cys(Trt) | Bachem | E-2495 | |
| Cys(tBu) | Bachem | B-1220 | |
| trifluoruacetic acid | Sigma Aldrich | 74564 | Toxic, Corrosive |
| phenol | Merck | 1002060 | Toxic |
| thioanisol | Alfa Aesar | A14846 | |
| ethanedithiol | Fluka Analytical | 2390 | |
| diethyl ether | VWR | 100,921 | Flammable |
| tert-butanol | Alfa Aesar | L12338 | Flammable |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | Flammable |
| water | Fisher Scientific | W5 | |
| isopropanol | VWR | ACRO42383 | Flammable |
| sodium hydroxide | AppliChem | A6579,1000 | Corrosive |
| iodoacetamide | Sigma Aldrich | I6125 | |
| iodine | Sigma Aldrich | I0385 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 110165 | Corrosive |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| diphenylsulfoxide | Sigma Aldrich | P35405 | |
| anisol | Sigma Aldrich | 96109 | Flammable |
| trichloromethylsilane | Sigma Aldrich | M85301 | Flammable |
| sample dilution buffer | Laborservice Onken | ||
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 106370 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | |
| (2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| citric acid | Sigma Aldrich | 251275 | |
| sodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | W302600 | |
| tris-acetate | Carl Roth, | 7125 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E26282 | |
| peptide calibration standard II | Bruker Daltonics GmbH | 8222570 | |
| Name of Equipment | Company | ||
| solid-phase peptide synthesizer | Intavis Bioanalytical Instruments AG | EPS 221 | |
| lyophilizer | Martin Christ GmbH | Alpha 1-2 Ldplus | |
| semipreparative HPLC | Jasco | system PV-987 | |
| Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) | Knauer | 25QE181E2J | purification of the linear peptide |
| Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP1022 | purification of the oxidized peptide |
| analytical HPLC | Shimadzu | system LC-20AD | |
| Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP54 | analytical column |
| ground steel target (MTP 384) | Bruker Daltonics GmbH | NC0910436 | MALDI preparation |
| C18-concentration filter (ZipTip) | Merck KGaA | ZTC18S096 | MALDI preparation |
| MALDI mass spectrometer | Bruker Daltonics GmbH | ultraflex III TOF/TOF | |
| amino acid analyzer | Eppendorf-Biotronik GmbH | LC 3000 system | |
| NMR spectrometer Bruker Avance III | Bruker Daltonics GmbH | Bruker Avance III 600 MHz | |
| computer program for molecular visualising | YASARA Biosciences GmbH | Yasara structures | NMR structure calculation |
| computer program for MALDI data evaluation | Bruker Daltonics GmbH | flexAnalysis, BioTools | MS/MS fragmentation |
| analog vortex mixer | VWR | VM 3000 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5410 | |
| Centrifuge | Hettich | EBA 20 | |
| Rotational vacuum concentrator | Christ | 2-18 Cdplus | |
| Analytical Balance | A&D Instruments | GR-202-EC |
References
- Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
- Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
- Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie – International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
- Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie – International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
- Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
- Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
- Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
- Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. Biochimie. 50 (17), 3414-3431 (2011).
- Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
- Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
- Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
- Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
- Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
- Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
- Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
- Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
- Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
- Kates, S. A., Albericio, F. . Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , (2000).
- Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie – International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).
