합성 및 다른 아 황산 연결 된 μ-Conotoxin PIIIA이 성체의 구조 결정
Summary
시스테인 부유한 펩 티 드 그들의 이황화 연결에 따라 고유한 3 차원 구조로 접어. 개별 이황화가 성체의 타겟된 합성 필요한 때 버퍼 산화 원하는 이황화 연결 리드 하지 않습니다. 프로토콜 선택 합성 펩 티 드 3 이황화 결합 그리고 NMR 및 MS/MS를 사용 하 여 그들의 구조 분석을 다루고 있다.
Abstract
펩 티 드 시스테인의 높은 숫자는 일반적으로 영향을 3 차원 구조에 관한 그들의 이황화 연결. 따라서 펩 티 드 종합, 동안 원치 않는 이황화 유대 형성을 피하기 위해 매우 중요 한 완전히 다른 펩 티 드 구조 될 수 있기 때문에 고 따라서 bioactivity를 변경. 그러나, 여러 개의 이황화 결합 펩 티 드의 올바른 형성 여러 이황화 연결 형성 될 수 있기 때문에 기존의 버퍼 산화 프로토콜 등 표준 자체 접는 방법을 사용 하 여 얻을 수 어렵습니다. 이 프로토콜은 여러 개의 이황화 다리 펩 티 드의 높은 품질과 수량에 버퍼 산화를 통해 종합 될 수 없는 어떤 대상된 합성에 필요한 고급 전략을 나타냅니다. 연구 타겟 방식에서 µ-conotoxin PIIIA의 모든 가능한 3 이황화 결합 펩 티 드가 성체의 합성에 대 한 뚜렷한 보호 그룹 전략의 응용 프로그램을 보여 줍니다. 펩 티 드 Fmoc 기반 단단한 단계 펩 티 드 종합 보호 그룹 전략을 사용 하 여 정의 된 이황화 결합 형성에 대 한에 의해 준비가 되어 있습니다. 시스테인의 각각 쌍 trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm)와 tert보호-있는지 확인 하는 모든 산화 단계 동안 필요한 시스테인은 deprotected 연결 그룹 부 틸 (t부) 보호. 대상된 종합 뿐만 아니라 여러 분석 방법의 조합이 올바른 병풍을 원하는 펩 티 드 구조의 세대를 명확 하 게 사용 됩니다. 다른 3 이황화 결합이 성체의 비교가 나타냅니다 이황화 연결의 3 차원 구조 계산 및 생물학의 해석에 대 한 지식과 정확한 결정의 중요성 펩 티 드가 성체의 활동입니다. 분석 특성 포함 적응된 프로토콜을 제작한 그대로 펩 티 드가 성체의 부분적으로 감소 하 고 alkylated 파생 상품으로 수행 되는 탠덤 질량 분석 (MS/MS) 분석을 통해 정확한 이황화 본드 설명 합니다. 또한, 펩 티 드 구조는 2 차원 핵 자기 공명 (NMR) 실험 및 MS/MS 분석에서 얻은 지식을 사용 하 여 결정 됩니다.
Introduction
제약 연구 및 개발에 생리 활성 펩 티 드를 사용 하 여 매우 그들은 특정 생물 학적 목표1에 대 한 강력 하 고 매우 선택적인 화합물을 대표 하기 때문에, 인식 된다. 그러나 그들의 bioactivity에 대 한, 3 차원 구조는 중요성의 구조 활동 관계 연구2,,34를 수행 하려면. 전체 구조에 영향을 미치는 기본 아미노산 시퀀스, 떨어져 이황화 결합 크게 시스테인 부유한 펩 티 드5의 구조를 안정화 합니다. 여러 개의 이황화 다리 펩 티 드 conotoxins µ-PIIIA의 순서로 6 시스테인 포함 Conus purpurascens 에서 같은 포함 됩니다. 이 높은 시스테인 콘텐츠는 이론적으로 15 이황화가 성체의 대형을 허용 한다. 올바른 이황화 연결 생물 학적 활동6,7에 대 한 매우 중요 하다. 그러나, 발생 하는 문제는 자연스럽 게 발생 펩 티 드의 경우, 그이 성체 중 가장 높은 생물 학적 활동을가지고 더 이상의 생리 구조 인지? Μ-conotoxins의 경우 생물 학적 목표 전압 개폐 나트륨 이온 채널, 그리고 μ-PIIIA 특히 하위 나V1.2, 나에 대 한 가장 강력한V1.4와 NaV1.73.
다양 한 방법을 사용 하 여 이황화 다리 펩 티 드의 종합을 얻을 수 있습니다. 펩 티 드 내의 이황화 결합의 대형을 위한 가장 편리한 방법은 소위 산화 자체 접는 방법입니다. 여기, 원하는 주기적인 펩 티 드의 선형 전조 먼저 고분자 지원에서 분열 산화 버퍼 시스템에 들어서는 후 단단한 단계 펩 티 드 종합을 사용 하 여 합성 됩니다. 감소와 산화 glutathione (GSH/GSSG) 같은 산화 활성 에이전트는 종종 이황화 결합의 형성을 촉진에 추가 됩니다. 폴딩 자체 버퍼 지원의 주요 단점은 이황화 결합 stepwise 방식에서 선택적으로 형성 하지는. 종종 하나의 특정 이황화 이성질체 설명, 네이티브 펩 티 드에 비해이 방법은8수많은 다른이 성체를 가능 하다. Μ-PIIIA 이미 적어도 3 개의 다르게 접힌된이 성체 자체는 이전 연구3폴딩 시에 결과를 보였다. 이러한 이성질체 혼합물의 분리는 컬럼에 정화 방법9을 사용 하는 경우 비슷한 보존 시간으로 인해 오히려 어렵습니다. 특정 이성질체의 타겟된 합성은 따라서 유리 하다. 정의 된 이황화 연결, 특별 한 전략으로 이성질체는 이황화는 채권에 필요한 구체적으로 생산 하는 연속적으로 닫힌다. 따라서, 개별 시스테인 쌍에 개별 보호 그룹을 들고 선형 전조 폴리머 지원에 합성 됩니다. 후 제거, 시스테인 쌍 개별적으로 연속적으로 deprotected 고 원하는 이황화 채권10,,1112,13, 를 생성 하는 산화 반응에 연결 14 , 15 , 16. 합성 반응 제품의 정화 후에, id 및 이황화 연결 확인에 필요한 적합 한 분석 방법. 수많은 분석 방법 기본 아미노산 순서, 예의 설명에 사용할 수 있습니다., MS/MS, 아 황산 연결의 결정 아직도 훨씬 적은 조사 남아 있는 동안. 이러한 여러 개의 이황화 결합 펩 티 드, 제품 관련 불순물의 복잡성은 그렇다 하 고 (예., 이황화 출 격에서), 때문에 샘플 준비 및 작업 업 수 더 복잡 하 게 분석. 이 논문에서는, 우리는 다른 분석 기술 조합의 사용은 명백 하 게 μ-PIIIA이 성체의 이황화 결합의 정체성을 명확히 하는 데 필요한 표시 됩니다. 우리 크로마 방법 질량 분석으로 결합 하 고 NMR 분광학에 동일한 샘플 제공. 매트릭스 보조 레이저 desorption/ionization(MALDI) MS/MS 분석, 우리는 불가능 하기 때문에 하향식 분석이 펩 티이 드에 대 한 부분적인 감소 및 iodoacetamide derivatization를 사용 하 여 이황화 채권 확인. 2 차원 NMR 실험은 각이 성체의 3 차원 구조를 얻기 위하여 수행 했다. 따라서, 결합 하 여 독특한 정교한 분석 방법, 그것은 명료 하 게 제대로 이황화 연결 및 복잡 한 3 차원 구조의 여러 이황화 결합 펩 티 드7수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
방법 여기에 설명 된 시스테인 부유한 펩 티 드의 합성에 대 한 같은 µ-PIIIA 동일한 아미노산 시퀀스에서 이황화 결합이 성체를 선택적으로 생산 하는 가능성을 나타냅니다. 그러므로, Fmoc 기반 솔리드 같은 펩 티 드 합성18 단계 고 이황화 결합의 regioselective 형성에 대 한 정의 된 보호 그룹 전략 사용된16설립. 단단한 단계 펩 티 드 합성 자동된 합성을 통해 폴리?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 A. Resemann, F. J. 메이어, 관련 브루 GmbH 브레멘;에서 D. Suckau 감사 하 고 싶습니다. D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts 및 C. Thiele 다름슈타트 기술 대학교; FLI 예 나, 본의 대학에서 M. Engeser에서에서 O. Ohlenschläger K. Kramer, A. Harzen, 및 식물 번 식 연구, 쾰른;의 막스 플랑크 연구소에서 H. 仲 동물학, 쾰른; 연구소에서 수잔 Neupert 그리고 바이오 자기 공명 분광학의 시설 프랑크푸르트의 대학 기술에 대 한 지원, 교육 모듈, 악기에 대 한 액세스. 알았다면 하 본의 대학에 의해 재정 지원은 기꺼이 인정 했다.
Materials
| Fmoc Rink amide resin | Novabiochem | 855001 | |
| Pyr(Boc) | Bachem | A-3850 | |
| Arg(Pbf) | Iris Biotech | FSC1010 | |
| Asn(Trt) | Bachem | B-1785 | |
| Asp(tBu) | Iris Biotech | FSP1020 | |
| Hyp(tBu) | Iris Biotech | FAA1627 | |
| Lys(Boc) | Bachem | B-1080 | |
| Ser(tBu) | Iris Biotech | FSC1190 | |
| Gln(Trt) | Iris Biotech | FSC1043 | |
| Glu(tBu) | Iris Biotech | FSP1045 | |
| Trp(Boc) | Iris Biotech | FSC1225 | |
| Tyr(tBu) | Sigma Aldrich | 47623 | |
| Thr(tBu) | Iris Biotech | FSP1210 | |
| His(Trt) | Iris Biotech | FDP1200 | |
| 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat | Sigma Aldrich | 8510060 | Flammable |
| DMF | Fisher Scientific | D119 | Flammable, Toxic |
| DCM | Fisher Scientific | D37 | Carcinogenic |
| Piperidine | Alfa Aesar | A12442 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| N-Methyl-Morpholin | Sigma Aldrich | 224286 | |
| Cys(Acm) | Iris Biotech | FAA1506 | |
| Cys(Trt) | Bachem | E-2495 | |
| Cys(tBu) | Bachem | B-1220 | |
| trifluoruacetic acid | Sigma Aldrich | 74564 | Toxic, Corrosive |
| phenol | Merck | 1002060 | Toxic |
| thioanisol | Alfa Aesar | A14846 | |
| ethanedithiol | Fluka Analytical | 2390 | |
| diethyl ether | VWR | 100,921 | Flammable |
| tert-butanol | Alfa Aesar | L12338 | Flammable |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | Flammable |
| water | Fisher Scientific | W5 | |
| isopropanol | VWR | ACRO42383 | Flammable |
| sodium hydroxide | AppliChem | A6579,1000 | Corrosive |
| iodoacetamide | Sigma Aldrich | I6125 | |
| iodine | Sigma Aldrich | I0385 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 110165 | Corrosive |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| diphenylsulfoxide | Sigma Aldrich | P35405 | |
| anisol | Sigma Aldrich | 96109 | Flammable |
| trichloromethylsilane | Sigma Aldrich | M85301 | Flammable |
| sample dilution buffer | Laborservice Onken | ||
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 106370 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | |
| (2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| citric acid | Sigma Aldrich | 251275 | |
| sodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | W302600 | |
| tris-acetate | Carl Roth, | 7125 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E26282 | |
| peptide calibration standard II | Bruker Daltonics GmbH | 8222570 | |
| Name of Equipment | Company | ||
| solid-phase peptide synthesizer | Intavis Bioanalytical Instruments AG | EPS 221 | |
| lyophilizer | Martin Christ GmbH | Alpha 1-2 Ldplus | |
| semipreparative HPLC | Jasco | system PV-987 | |
| Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) | Knauer | 25QE181E2J | purification of the linear peptide |
| Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP1022 | purification of the oxidized peptide |
| analytical HPLC | Shimadzu | system LC-20AD | |
| Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP54 | analytical column |
| ground steel target (MTP 384) | Bruker Daltonics GmbH | NC0910436 | MALDI preparation |
| C18-concentration filter (ZipTip) | Merck KGaA | ZTC18S096 | MALDI preparation |
| MALDI mass spectrometer | Bruker Daltonics GmbH | ultraflex III TOF/TOF | |
| amino acid analyzer | Eppendorf-Biotronik GmbH | LC 3000 system | |
| NMR spectrometer Bruker Avance III | Bruker Daltonics GmbH | Bruker Avance III 600 MHz | |
| computer program for molecular visualising | YASARA Biosciences GmbH | Yasara structures | NMR structure calculation |
| computer program for MALDI data evaluation | Bruker Daltonics GmbH | flexAnalysis, BioTools | MS/MS fragmentation |
| analog vortex mixer | VWR | VM 3000 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5410 | |
| Centrifuge | Hettich | EBA 20 | |
| Rotational vacuum concentrator | Christ | 2-18 Cdplus | |
| Analytical Balance | A&D Instruments | GR-202-EC |
References
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