Cystein-rik peptider brett i forskjellige tredimensjonale strukturer avhengig av disulfide tilkoblingen. Målrettet syntese av personlige disulfide isomerene kreves når bufferen oksidasjon ikke fører til ønsket disulfide tilkobling. Protokollen avtaler med selektiv syntesen av 3-disulfide-limt peptider og strukturell analyse bruker NMR og MS-/ MS studier.
Peptider med et høyt antall cysteinene påvirkes vanligvis om tredimensjonale strukturen av disulfide tilkoblingen. Det er derfor svært viktig å unngå uønskede disulfide obligasjon formasjon under peptid syntese, fordi det kan resultere i en helt annen peptid struktur, og derfor endret bioactivity. Riktig dannelsen av flere disulfide obligasjoner i et peptid er imidlertid vanskelig å få ved å bruke standard selv folding metoder som konvensjonelle buffer oksidasjon protokoller, fordi flere disulfide connectivities kan dannes. Denne protokollen representerer en avansert strategi kreves for målrettet syntesen av flere disulfide-bro peptider som ikke kan syntetiseres via buffer oksidasjon i høy kvalitet og kvantitet. Studien viser anvendelsen av en distinkt beskytte gruppe strategi for syntese av alle mulige 3-disulfide-limt peptid en μ-conotoxin PIIIA på en målrettet måte. Peptidene er utarbeidet av Fmoc-basert solid fase peptid syntese bruker en beskyttelse gruppe strategi for definerte disulfide obligasjon formasjon. Respektive parene av cysteinene er beskyttet med trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) og tert-butyl (tBu) beskytte grupper for å sikre at under hvert oksidasjon steg bare de nødvendige cysteinene er deprotected og koblet. I tillegg til målrettet syntese, en kombinasjon av flere analytiske metoder til å avklare riktig folding og generasjon av ønsket peptid strukturer. Sammenligning av de ulike 3-disulfide-limt isomerene indikerer viktigheten av nøyaktig bestemmelse og kunnskap om disulfide tilkobling for beregning av tredimensjonale strukturen og tolkning av biologisk aktivitet av peptid isomerene. Analytiske karakterisering inneholder nøyaktig disulfide obligasjon forklaring via tandem massespektrometri (MS-/ MS) analyse som utføres med delvis redusert og alkylated derivater av intakt peptid-isomer produsert av en tilpasset protokoll. Videre fastsettes peptid strukturer ved hjelp av 2D kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) eksperimenter og kunnskap fra MS-/ MS analyse.
Bruk av bioaktive peptider i farmasøytisk forskning og utvikling er anerkjente, fordi de representerer potent og svært selektive forbindelser for bestemte biologiske mål1. For sine bioactivity, men er den tredimensjonale strukturen av stor betydning for å utføre struktur aktivitet forholdet studier2,3,4. Bortsett fra den primære aminosyre sekvensen som påvirker den totale konformasjon, stabilisere disulfide obligasjoner betydelig strukturen til cystein-rik peptider5. Flere disulfide-bro peptider inkluderer conotoxins som μ-PIIIA fra Conus purpurascens som inneholder seks cysteinene i sekvensen. Høy cystein innholdet kan teoretisk dannelsen av 15 disulfide isomerene. Riktig disulfide tilkobling er svært viktig for biological aktivitet6,7. Men spørsmålet som oppstår er om det er flere bioaktive konformasjon av naturlig forekommende peptider og hvis så, hvilke av disse isomerene besitter høyeste biologiske aktivitet? Ved μ-conotoxins, biologiske målene er spenning-gated natrium ionekanaler og μ-PIIIA spesielt er mest potente for subtyper NaV1.2, NaV1.4 og NaV1.73.
Syntese av disulfide-bro peptider kan oppnås ved hjelp av ulike metoder. Den mest hensiktsmessige metoden for dannelsen av disulfide obligasjoner i et peptid er såkalte oksidativt selv folding tilnærming. Her er lineær forløperen til den ønskede syklisk peptid syntetisert først bruker solid-fase peptid syntese, som er etter cleavage fra polymere støtte utsatt for oksidasjon i en buffer system. Redoks-aktive stoffer som redusert og oksidert glutathione (GSH/GSSG) er ofte lagt til fremme dannelsen av disulfide obligasjoner. Det hovedavdeling ulempen av buffer-støttet selv folding er at av disulfide obligasjoner ikke er dannet selektivt i en gradvis mote. Sammenlignet med den opprinnelige peptid, som ofte bare en bestemt disulfide isomer er beskrevet, er det mulig å få mange andre isomerene med denne tilnærmingen8. Μ-PIIIA har allerede vist resulterer i minst tre annerledes foldet isomerene på selv kaste i en tidligere studie3. Separasjon av slik en isomer blanding er ganske vanskelig på grunn av lignende tid hvis bruker brukt kromatografiske rensing metoder9. Målrettet syntesen av en bestemt isomer er derfor en fordel. Spesielt produsere en isomer med definerte disulfide tilkobling, en spesiell strategi er nødvendig som av disulfide obligasjoner er suksessivt lukket. Derfor er lineær forløperen bærer beskyttelse grupper på individuelle cystein parene syntetisert på polymer støtte. Etter eliminering, cystein parene er individuelt og suksessivt deprotected og koblet en oksidasjon reaksjon til ønsket disulfide obligasjoner10,11,12,13, 14 , 15 , 16. etter syntese og rensing av reaksjon produktet, er det nødvendig å bekrefte identiteten og disulfide tilkobling av egnet analytiske metoder. Mange analytiske metoder er tilgjengelige for utviklingen av de primære aminosyresekvens, f.eks., MS-/ MS, mens fastsettelse av disulfide tilkobling fortsatt mye mindre undersøkt. Fra kompleksiteten av slike flere disulfide-limt peptider, produktrelaterte urenheter (f.eks., fra disulfide desperat), på grunn av prøven forberedelse og arbeidet opp kan ytterligere komplisere analyse. I dette papiret viser vi at bruk av en kombinasjon av forskjellige analytiske teknikker er nødvendig å avklare utvetydig identiteten av disulfide obligasjoner i μ-PIIIA isomerene. Vi har kombinert brukt kromatografiske metoder med massespektrometri og gitt samme prøvene å NMR spektroskopi. I matrix-assistert laser desorption/ionization(MALDI) MS-/ MS analyse identifisert vi av disulfide obligasjoner med delvis reduksjon og iodoacetamide derivatization fordi ovenfra og ned analyse ikke er mulig for denne peptid. 2D NMR eksperimenter ble utført for å få en tredimensjonal struktur av hver isomer. Dermed, ved å kombinere forskjellige avanserte analytiske metoder, er det mulig å belyse riktig disulfide tilkobling og tredimensjonale strukturen i komplekse flere disulfide-limt peptider7.
Metoden beskrevet her for syntese av cystein-rik peptider som μ-PIIIA representerer en mulighet til å produsere selektivt disulfide-limt isomerene fra samme aminosyresekvens. Derfor etablerte metoder som Fmoc-basert solid fase peptid syntese18 og en definert beskytte gruppe strategi for regioselective dannelsen av disulfide obligasjoner ble brukt16. Solid-fase peptid syntese kan produsere amino acid sekvenser på en polymer støtte (harpiks) via automatisert syntese. Diss…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke A. Resemann, F. J. Mayer og D. Suckau fra Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts og C. Thiele fra Darmstadt University of Technology; O. Ohlenschläger fra FLI Jena, M. Engeser fra Universitetet i Bonn; K. Kramer, A. Harzen og H. Nakagami fra Max Planck Institute for planteforskning avl, Köln; Susanne Neupert fra Institute for zoologi, Köln; og Biomolecular magnetisk resonans spektroskopi fasilitetene på universitet i Frankfurt for teknisk støtte, opplæringsmoduler, og tilgang til instrumenter. Økonomisk støtte ved Universitetet i Bonn til di er takknemlig anerkjent.
Fmoc Rink amide resin | Novabiochem | 855001 | |
Pyr(Boc) | Bachem | A-3850 | |
Arg(Pbf) | Iris Biotech | FSC1010 | |
Asn(Trt) | Bachem | B-1785 | |
Asp(tBu) | Iris Biotech | FSP1020 | |
Hyp(tBu) | Iris Biotech | FAA1627 | |
Lys(Boc) | Bachem | B-1080 | |
Ser(tBu) | Iris Biotech | FSC1190 | |
Gln(Trt) | Iris Biotech | FSC1043 | |
Glu(tBu) | Iris Biotech | FSP1045 | |
Trp(Boc) | Iris Biotech | FSC1225 | |
Tyr(tBu) | Sigma Aldrich | 47623 | |
Thr(tBu) | Iris Biotech | FSP1210 | |
His(Trt) | Iris Biotech | FDP1200 | |
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat | Sigma Aldrich | 8510060 | Flammable |
DMF | Fisher Scientific | D119 | Flammable, Toxic |
DCM | Fisher Scientific | D37 | Carcinogenic |
Piperidine | Alfa Aesar | A12442 | Flammable, Toxic, Corrosive |
N-Methyl-Morpholin | Sigma Aldrich | 224286 | |
Cys(Acm) | Iris Biotech | FAA1506 | |
Cys(Trt) | Bachem | E-2495 | |
Cys(tBu) | Bachem | B-1220 | |
trifluoruacetic acid | Sigma Aldrich | 74564 | Toxic, Corrosive |
phenol | Merck | 1002060 | Toxic |
thioanisol | Alfa Aesar | A14846 | |
ethanedithiol | Fluka Analytical | 2390 | |
diethyl ether | VWR | 100,921 | Flammable |
tert-butanol | Alfa Aesar | L12338 | Flammable |
acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | Flammable |
water | Fisher Scientific | W5 | |
isopropanol | VWR | ACRO42383 | Flammable |
sodium hydroxide | AppliChem | A6579,1000 | Corrosive |
iodoacetamide | Sigma Aldrich | I6125 | |
iodine | Sigma Aldrich | I0385 | |
Hydrochloric acid | Merck | 110165 | Corrosive |
ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
diphenylsulfoxide | Sigma Aldrich | P35405 | |
anisol | Sigma Aldrich | 96109 | Flammable |
trichloromethylsilane | Sigma Aldrich | M85301 | Flammable |
sample dilution buffer | Laborservice Onken | ||
sodium dihydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 106370 | |
disodium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | |
(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
citric acid | Sigma Aldrich | 251275 | |
sodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | W302600 | |
tris-acetate | Carl Roth, | 7125 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E26282 | |
peptide calibration standard II | Bruker Daltonics GmbH | 8222570 | |
Name of Equipment | Company | ||
solid-phase peptide synthesizer | Intavis Bioanalytical Instruments AG | EPS 221 | |
lyophilizer | Martin Christ GmbH | Alpha 1-2 Ldplus | |
semipreparative HPLC | Jasco | system PV-987 | |
Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) | Knauer | 25QE181E2J | purification of the linear peptide |
Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP1022 | purification of the oxidized peptide |
analytical HPLC | Shimadzu | system LC-20AD | |
Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP54 | analytical column |
ground steel target (MTP 384) | Bruker Daltonics GmbH | NC0910436 | MALDI preparation |
C18-concentration filter (ZipTip) | Merck KGaA | ZTC18S096 | MALDI preparation |
MALDI mass spectrometer | Bruker Daltonics GmbH | ultraflex III TOF/TOF | |
amino acid analyzer | Eppendorf-Biotronik GmbH | LC 3000 system | |
NMR spectrometer Bruker Avance III | Bruker Daltonics GmbH | Bruker Avance III 600 MHz | |
computer program for molecular visualising | YASARA Biosciences GmbH | Yasara structures | NMR structure calculation |
computer program for MALDI data evaluation | Bruker Daltonics GmbH | flexAnalysis, BioTools | MS/MS fragmentation |
analog vortex mixer | VWR | VM 3000 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5410 | |
Centrifuge | Hettich | EBA 20 | |
Rotational vacuum concentrator | Christ | 2-18 Cdplus | |
Analytical Balance | A&D Instruments | GR-202-EC |