Summary

Induzione di differenziazione endoteliale in cellule progenitrici cardiache in condizioni di basso del siero

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Questo protocollo descrive una tecnica di differenziazione endoteliale di cellule progenitrici cardiache. Si concentra in particolare su come la concentrazione nel siero e la densità di semina delle cellule influenzano il potenziale di differenziazione endoteliale.

Abstract

Cellule progenitrici cardiache (CPCs) possono avere potenziale terapeutico per la rigenerazione cardiaca dopo la ferita. Nel cuore dei mammiferi adulto, intrinseca CPC sono estremamente scarse, ma espanso CPCs potrebbe essere utile per la terapia cellulare. Un prerequisito per il loro uso è la loro capacità di differenziarsi in modo controllato nei vari lignaggi cardiaci utilizzando protocolli definiti ed efficienti. Inoltre, all’espansione in vitro , CPCs isolati da pazienti o malattia preclinica modelli possono offrire strumenti di ricerca fruttuosa per l’indagine sui meccanismi della malattia.

Gli studi correnti utilizzano differenti marcatori per identificare CPCs. Tuttavia, non tutti sono espressi in esseri umani, che limita l’impatto traslazionale di alcuni studi preclinici. Protocolli di differenziazione che siano applicabili indipendentemente dall’espressione tecnica e marcatore di isolamento consentirà l’espansione standardizzati e adescamento di CPC per scopo di terapia cellulare. Qui descriviamo che facilita l’innesco di CPC sotto una concentrazione bassa nel siero bovino fetale (FBS) e condizioni di densità bassa delle cellule la differenziazione endoteliale del CPCs. utilizzando due differenti sottopopolazioni di topo e di ratto CPCs, indichiamo che laminin è un più substrato adatto di fibronectina per questo scopo sotto il seguente protocollo: dopo la coltura per 2-3 giorni in mezzo compresi gli integratori che mantenere multipotenza e con 3,5% FBS, CPC sono seminati su laminina a < 60% confluenza e coltivate in medium senza supplemento con basse concentrazioni di FBS (0,1%) per 20-24 ore prima differenziazione in mezzo di differenziazione endoteliale. Perché CPC sono una popolazione eterogenea, le concentrazioni nel siero e tempi di incubazione potrebbero essere necessario essere regolata a seconda delle proprietà della sottopopolazione rispettiva CPC. Considerando questo, la tecnica può essere applicata ad altri tipi di CPC anche e fornisce un metodo utile per studiare i meccanismi di differenziazione e come essi sono influenzati dalla malattia quando si utilizza il CPCs isolato dai modelli rispettivi malattia e potenziale.

Introduction

Gli studi recenti sostengono l’esistenza di cellule progenitrici cardiache residenti (CPCs) nel cuore di un mammifero adulto1,2,3, e CPC potrebbe essere una fonte utile per la terapia cellulare dopo lesione cardiaca4, 5. Inoltre, espanso CPCs può fornire un modello fecondo per lo screening di stupefacenti e lo studio dei meccanismi di malattia quando isolati da pazienti con rare malattie del miocardio o da malattia rispettiva modelli6,7.

CPC isolate da cuore adulto possiedono cellule staminali/progenitrici delle cellule caratteristiche1,2,3,8 come sono multipotenti, clonogeniche, e hanno la capacità di auto-rinnovamento. Tuttavia, ci sono molti differenti (sotto) popolazioni di CPC che presentino profili marcatore di superficie differenti, tra cui, ad esempio, c-kit, Sca-1 e altri, o estratto mediante tecniche di isolamento diverso (tabella 1). Diversi protocolli di differenziazione e cultura sono stati stabiliti1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Questi protocolli variano soprattutto per quanto riguarda il fattore di crescita e il contenuto di siero, che vengono regolati in base allo scopo della coltura e che possono causare differenze nei risultati e risultati, compresa l’efficienza differenziazione.

Tecniche di isolamento basati su marker:

CPC può essere isolato basato su un indicatore della superficie specifica espressione1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Gli studi precedenti suggeriscono che il c-kit e Sca-1 può essere i migliori marcatori per isolare residente CPCs1,11,14,19,20. Perché nessuno di questi indicatori è veramente specifica per CPCs, solitamente vengono applicate le combinazioni di marcatori diversi. Ad esempio, mentre CPCs esprimono bassi livelli di c-kit21, c-kit è espressa anche da altri tipi di cellule, tra cui mastociti22, cellule endoteliali23e di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche24. Un ulteriore problema è il fatto che non tutti gli indicatori sono espressi in tutte le specie. Questo è il caso per Sca-1, che si esprime nel topo ma non nell’umano25. Pertanto, utilizzando protocolli che sono indipendenti di marcatori di isolamento può essere vantaggioso in considerazione studi clinici e studi utilizzando campioni umani.

Tecniche di isolamento di marcatore indipendente:

Ci sono diverse tecniche principali di isolamento CPC, che sono principalmente indipendenti dell’espressione dei marker di superficie, ma che può essere affinata dalla selezione consecutiva di specifici marcatori positivi subfractions come necessario (vedere anche tabella 1). (1) la tecnica di popolazione (SP) lato originalmente è stata caratterizzata in una primitiva popolazione di cellule staminali ematopoietiche basato sulla capacità di deflusso il colorante DNA Hoechst 3334226 di ATP-binding cassette (ABC) trasportatori27. Cellule cardiache SP sono state isolate da diversi gruppi e segnalate per esprimere una varietà di indicatori con alcune lievi differenze tra rapporti2,8,13,14. (2) le cellule del fibroblasto unità formazione di colonie (CFU-Fs) originalmente sono state definite basato su una cellula stromal mesenchymal (MSC)-come il fenotipo. MSCs isolato sono coltivate su piatti per indurre la formazione della Colonia. Tale formazione di colonie MSC-come CFU-Fs possono essere isolate da cuore adulto e sono in grado di differenziarsi in lignaggi cardiaco15. (3) cellule cardiosfere (CDC) sono singole cellule derivate da aggregati di cellule coltivate da biopsie dei tessuti o espianti28,29,30,31. Recentemente è stato dimostrato che per lo più il CD105+/CD90 frazione di cellule /c-kit esibisce cardiomiogenici e potenziale rigenerativo32.

Qui, utilizzando SP-CPCs isolate da topi, forniamo un protocollo per l’induzione efficiente di stirpe endothelial basato su uno studio precedente in ratto CPCs e mouse SP-CPCs33. Il protocollo contiene specifici adattamenti alla cultura e tecnica di espansione per quanto riguarda la densità delle cellule, il contenuto di siero del mezzo e il substrato. Esso può essere applicato non solo al mouse SP-CPC ma di diversi tipi di CPC per lo scopo di indurre un interruttore di destino da un’amplificazione di un CPC endoteliale commesso, sia esso in considerazione il trapianto di queste cellule o dal loro impiego per gli studi meccanicistici in vitro .

Protocol

L’uso di topi per scopo di isolamento cellulare era in conformità con la guida per la cura e l’uso di animali da laboratorio e con la legge di protezione animale Svizzera ed è stato approvato dalle autorità cantonali svizzere. Nota: L’isolamento di Sca-1+/CD31– SP-CPCs dal cuore del mouse essenzialmente è stato fatto come descritto in precedenza34 con alcune modifiche. Per i materiali e i reagenti utilizzati, Vedi Tabella materiali</s…

Representative Results

Isolamento di SP-CPC del mouse: In questo studio, abbiamo usato del mouse CPCs isolato secondo il fenotipo di SP, considerando che risultati da ratto CPC sono modificati e aggiunto da una precedente relazione con autorizzazione (Figura 8)33. Proliferazione delle cellule in cella ad alta e bassa densità e con le concentra…

Discussion

Vantaggi di questo protocollo:

Questo protocollo fornisce una tecnica di differenziazione endoteliale di CPC. Abbiamo trovato che una concentrazione bassa nel siero e la densità delle cellule basso potrebbe migliorare l’efficienza della differenziazione endoteliale, per cui LN ha dimostrato di essere un substrato più adatto di FN in queste condizioni. Abbiamo usato due tipi distinti di CPC: ratto CPCs, che sono stati utilizzati in maniera linea-come delle cellule e mouse SP-CPC, che sono stati …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Vera Lorenz per il suo sostegno utile durante gli esperimenti e il personale dell’impianto di citometria a flusso dal dipartimento di biomedicina (DBM), Università e ospedale universitario di Basilea. Questo lavoro è stato supportato dal soggiorno-su pista programma presso l’Università di Basilea (per Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster è sostenuta da una sovvenzione della Swiss National Science Foundation (concessione numero 310030_156953).

Materials

Culture medium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) ThermoFisher #12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham Merck #D8437
Penicillin-Streptomycin (P/S) ThermoFisher #15140122
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071 3.5% (0.1% for lineage induction)
L-Glutamine  ThermoFisher #25030 Final concentration 2 mM
Glutathione Merck #G6013
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech #AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Peprotech #AF-100-18B
B27 Supplement ThermoFisher #17504044
Cardiotrophin 1  Peprotech #250-25
Thrombin Diagontech AG, Switzerland #100-125
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) ThermoFisher #14170
0.05 % Trypsin-EDTA ThermoFisher #25300
T75 Flask Sarstedt #83.3911
Endothelial differentiation  
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit Lonza #CC-3162
Ham's F-12K (Kaighn's) Medium ThermoFisher #21127
Laminin  Merck #L2020
Fibronectin  Merck #F4759 Dilute in ddH2O
6 Well Plate Falcon #353046
Formaldehyde Solution Merck #F1635 Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)
Triton X-100 Merck #93420 0.1% in ddH2O
Normal Goat Serum (10%) ThermoFisher #50062Z
Anti-von Willebrand Factor antibody Abcam #ab6994 1:100 in 10% goat serum
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 ThermoFisher #A11010 1:500 in 10% goat serum
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) ThermoFisher #62247 1:500 in ddH2O 
SlowFade Antifade Kit ThermoFisher #S2828
BX63 widefield microscope Olympus
Tube formation
96 Well Plate Falcon #353072
5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap Falcon #352235
Matrigel Growth Factor Reduced Corning #354230
IX50 widefield microscope Olympus
Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 
Reagents
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. in house hospital pharmacy #9077862 Working solution: 200 mg/kg
Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) ThermoFisher #20012
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) ThermoFisher #14175 Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS  for quenching Collagenase B activity 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate ThermoFisher #331885 Prepare DMEM + 10% FBS  + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining
Penicillin-Streptomycin  (P/S) ThermoFisher #15140122
HEPES 1 M ThermoFisher #15630080 Final concentration 25 mM
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071
RBC LysisBuffer (10X) BioLegend #420301/100mL Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter
Collagenase B Merck #11088807001 Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter
bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) Merck #B2261 Prepare 1 mg/mL in ddH2O
Verapamil-hydrochloride  Merck #V4629 Final concentration 83.3 µM 
APC Rat Anti-Mouse CD31 BD Biosciences #551262 0.25 µg/107cells
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) BD Biosciences #557405 0.6 µg/107cells
7-Aminoactinomycin D (7-ADD) ThermoFisher #A1310 0.15 µg/106cells
APC rat IgG2a k Isotype Control BD Biosciences #553932 0.25 µg/107cells
FITC Rat IgG2a k Isotype Control BD Biosciences #554688 0.6 µg/107cells
Material
Needles 27G Terumo #NN-2719R
Needles 18G Terumo #NN-1838S
Single Use Syringes 1 mL sterile CODAN #62.1640
Transferpipette 3.5 mL Sarstedt #86.1171.001
Cell Strainer 40 µm blue BD Biosciences  #352340
Cell Strainer 100 µm yellow BD Biosciences #352360
Lumox Dish 50 Sarstedt #94.6077.305
Culture Dishes P100 Corning #353003
Culture Dishes P60 Corning #353004
Mouse
Line Age Breeding
C57BL/6NRj / male 12 weeks in house
Product Name Company Catalogue No.
Reagents
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) ThermoFisher #12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham Merck #D8437
Penicillin-Streptomycin  (P/S) ThermoFisher #15140122
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071
L-Glutamine  ThermoFisher #25030
Glutathione Merck #G6013
B27 Supplement ThermoFisher #17504044
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech #AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Peprotech #AF-100-18B
Cardiotrophin 1  Peprotech #250-25
Thrombin Diagontech AG, Switzerland  #100-125
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit Lonza #CC-3162
Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. 
Product Name Medium 18 Medium 2 Medium 3
Reagents Culture Lineage induction Endothelial diff.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 35% 35%
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham 65% 65%
Penicillin-Streptomycin  (P/S) 1% 1%
Fetal Bovine Serum (FBS) 3.5% ≤0.1%
L-Glutamine  2 mM 2 mM
Glutathione 0.2 nM 0.2 nM
B27 Supplement 1.3%
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) 6.5 ng/mL
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) 13 ng/mL
Cardiotrophin 1  0.65 ng/mL

References

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Citer Cet Article
Mochizuki, M., Della Verde, G., Soliman, H., Pfister, O., Kuster, G. M. Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions. J. Vis. Exp. (143), e58370, doi:10.3791/58370 (2019).

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