Depuración catalítica de planta oxígeno reactivo especie In Vivo de nanopartículas de óxido de cerio aniónicos
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la síntesis y caracterización de nanopartículas de óxido de cerio (nanoceria) de ROS (especies reactivas del oxígeno) barrido en vivo, nanoceria proyección de imagen en los tejidos vegetales por microscopía confocal e in vivo seguimiento de nanoceria ROS barrido por microscopia confocal.
Abstract
Acumulación de oxígeno reactivo (ROS) las especies es un rasgo distintivo de la respuesta de estrés abiótico las plantas. ROS desempeñan un papel dual en las plantas actuando como señales de moléculas en niveles bajos y dañar moléculas en niveles altos. Acumulación de ROS en plantas puede dañar metabolitos, enzimas, lípidos y ADN, provocando una reducción del crecimiento de las plantas y el rendimiento. La capacidad de compactar catalítico ROS en vivo de nanopartículas de óxido de cerio (nanoceria) proporciona una herramienta única para entender y tolerancia al estrés abiótico planta bioingeniero. Aquí, presentamos un protocolo para sintetizar y caracterizar poly (acrílico) ácido nanoceria revestido (PNC), interfaz de las nanopartículas con plantas vía infiltración de lámina de la hoja y controlar su distribución y ROS rebuscar en vivo usando confocal microscopia. Actuales herramientas moleculares para manipular la acumulación de ROS en las plantas se limitan a especies modelo y requieren métodos de transformación laboriosa. Este protocolo en vivo barrido ROS tiene el potencial para aplicarse a las plantas de tipo silvestre con hojas anchas y estructura de las hojas como Arabidopsis thaliana.
Introduction
Nanopartículas de óxido de cerio (nanoceria) son ampliamente utilizadas en los organismos vivos, desde la investigación básica a la bioingeniería, debido a sus especies distintas catalítico reactivas del oxígeno (ROS) barrido capacidad1,2,3. Nanoceria tienen ROS barrido capacidades debido a un gran número de vacantes de oxígeno superficial que se alternan entre dos oxidación Estados (Ce3 + y Ce4 +) 4,5,6. Los Ce3 + colgando los bonos efectivamente barrido ROS mientras que las cepas de enrejado en la nanoescala promueven la regeneración de estos sitios de defecto mediante redox reacciones7de ciclismo. Nanoceria también se han utilizado recientemente para estudiar e Ingeniería de la planta función8,9. Plantas bajo estrés abiótico experimentan acumulación de ROS, que causa daño oxidativo a lípidos, proteínas y ADN10. En plantas de a. thaliana , nanoceria depuración catalítica de ROS en vivo conduce a la fotosíntesis de la planta mejorada bajo la alta luz, calor y frío estrés8. Nanoceria aplicando al suelo también aumenta sesión de biomasa y rendimiento de grano de trigo (Triticum aestivum)11; las plantas de canola (Brassica napus) tratadas con nanoceria tienen mayor biomasa de la planta bajo estrés salino12.
Nanoceria ofrecemos bioingenieros y biólogos de la planta una herramienta basada en nanotecnología para entender las respuestas de estrés abiótico y mejorar la tolerancia al estrés abiótico planta. En vivo ROS barridas capacidades de Nanoceria independientes de especies de plantas, y la entrega fácil en los tejidos de la planta tiene el potencial para permitir amplia aplicación fuera de organismos modelo. A diferencia de otros métodos basados en la genética, nanoceria no requieren generar líneas de plantas con la sobreexpresión de enzimas antioxidantes para ROS mayor compactación capacidad13. Infiltración de lámina de la hoja de nanoceria a las plantas es un enfoque práctico para la investigación de laboratorio.
El objetivo general de este protocolo es describir 1) la síntesis y caracterización de poly cargados negativamente (acrílico) ácido nanoceria (PNC), 2) la entrega y seguimiento de la PNC a través de células de la hoja y 3) el monitoreo de depuración PNC permitió ROS en vivo. En este protocolo, poly cargados negativamente (acrílico) ácido nanoceria (PNC) son sintetizados y caracterizados por su espectro de absorción, diámetro hidrodinámico y potencial zeta. Se describe un método de infiltración de lámina de hoja simple para entregar PNC en planta de tejidos de la hoja. En vivo imagen de distribución de nanopartículas en las células del mesófilo, un colorante fluorescente (DiI) fue utilizado para la etiqueta de PNC (DiI-PNC) y observar las nanopartículas mediante microscopía de fluorescencia confocal. Por último, explicamos cómo monitorear en vivo PNC ROS barrido a través de microscopía confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, describimos PNC síntesis, caracterización, colorante fluorescente etiquetado y proyección de imagen confocal de las nanopartículas en las células mesophyll vegetales para exhibir su en vivo ROS actividad libre-radical. PNC se sintetizan a partir de una mezcla de solución PAA en hidróxido de amonio y nitrato de cerio. PNC se caracterizan por spectrophotomery de absorción y la concentración determinada mediante ley de la cerveza-Lamberts. Medidas de potencial zeta confirman la superfici…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Universidad de California, Riverside y USDA Instituto Nacional de alimentos y agricultura, proyecto de Portilla 1009710 J.P.G. Este material está basado en trabajo apoyado por la National Science Foundation bajo la subvención no. 1817363 a J.P.G.
Materials
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
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