Katalytische opruiming van Plant reactieve zuurstof soorten In Vivo door anionogene Cerium Oxide nanodeeltjes
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de synthese en de karakterisering van nanodeeltjes (nanoceria) oxide cerium voor ROS (reactieve zuurstof soorten) opruiming in vivo, nanoceria in plantaardige weefsels door confocale microscopie en in vivo imaging monitoring van nanoceria ROS opruiming door confocale microscopie.
Abstract
Accumulatie van reactieve zuurstof soorten (ROS) is een kenmerk van de plant abiotische stress-respons. ROS spelen een dubbelrol in planten door op te treden als signalering moleculen op een laag niveau en schadelijke moleculen op een hoog niveau. Accumulatie van ROS in gespannen planten kan beschadigen metabolieten, enzymen, lipiden en DNA, waardoor een vermindering van de plantengroei en rendement. Het vermogen van cerium oxide nanodeeltjes (nanoceria) om catalytically opruimen ROS in vivo biedt een uniek instrument te begrijpen en bioengineer plant abiotische stress tolerantie. Hier presenteren we een protocol om te synthetiseren en karakteriseren van poly (acryl) zure gecoate nanoceria (PNC) interface van de nanodeeltjes met planten via blad lamina infiltratie en controleren van hun distributie en ROS opruiming in vivo met behulp van de confocal microscopie. Huidige moleculaire tools voor het manipuleren van ROS accumulatie in planten zijn beperkt tot model soorten en moeizame transformatie methoden vereisen. Dit protocol voor in vivo opruiming ROS heeft het potentieel om te worden toegepast op wild type planten met brede bladeren en blad structuur zoals Arabidopsis thaliana.
Introduction
Cerium oxide nanodeeltjes (nanoceria) worden veel gebruikt in levende organismen, van fundamenteel onderzoek naar bioengineering, als gevolg van hun verschillende katalytische reactieve zuurstof soorten (ROS) opruiming vermogen1,2,3. Nanoceria hebben ROS opruiming capaciteiten als gevolg van een groot aantal oppervlakte zuurstof vacatures die afwisselend twee oxidatie Staten (Ce3 + en CE-4 +) 4,5,6. ROS opruimen de Ce3 + bungelende obligaties effectief terwijl de lattice stammen op nanoschaal bevorderen het herstel van deze defect sites via redox reacties7fietsen. Nanoceria zijn ook recent gebruikt voor het bestuderen van engineering-en pootgoed en functie8,9. Planten onder abiotische stress Ervaar accumulatie van ROS, oxidatieve schade aan lipiden, eiwitten en DNA10. In A. thaliana planten leidt nanoceria katalytische opruiming van ROS in vivo tot verbeterde plant fotosynthese onder hoge licht, warmte en koelen benadrukt8. Toepassing nanoceria bodememissies ook verhogingen schieten biomassa en graan opbrengst van tarwe (Triticum aestivum)11; koolzaad (Brassica napus) planten behandeld met nanoceria hebben hogere plantaardige biomassa onder zout stress12.
Nanoceria bieden bioengineers en planten biologen een nanotechnologie gebaseerde hulpprogramma abiotische stress reacties te begrijpen en te verbeteren plant abiotische stress tolerantie. Nanoceria de in vivo ROS opruiming mogelijkheden zijn onafhankelijk van plantensoorten, en de facile levering in plantaardige weefsels heeft het potentieel om de brede toepassing buiten modelorganismen inschakelen. In tegenstelling tot andere genetisch gebaseerde methoden, nanoceria vereisen geen krommen van de plant met de overexpressie van antioxidant enzymen voor hogere ROS opruiming vermogen13. Blad lamina infiltratie van nanoceria aan planten is een praktische benadering voor lab gebaseerde onderzoek.
Het algemene doel van dit protocol is voor het beschrijven van 1) de synthese en karakterisering van negatief geladen poly (acryl) zure nanoceria (PNC), 2) de levering en tracking van PNC hele blad cellen, en 3) de bewaking van de PNC ingeschakelde ROS opruiming in vivo. In dit protocol zijn negatief geladen poly (acryl) zure nanoceria (PNC) gesynthetiseerd en gekenmerkt door hun absorptiespectrum, hydrodynamische diameter en zeta potentiële. Beschrijven we een eenvoudige blad lamina infiltratie methode om te leveren PNC in plant blad weefsels. Voor in vivo imaging van nanoparticle distributie binnen mesophyl cellen, was een fluorescente kleurstof (DiI) gewend label PNC (DiI-PNC) en observeren van de nanodeeltjes via confocal fluorescentie microscopie. Tot slot, we uitleggen hoe om te controleren in vivo PNC ROS opruiming via confocale microscopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol beschrijven we PNC synthese, karakterisering, fluorescente kleurstof labeling en confocal beeldvorming van de nanodeeltjes in plantencellen mesophyl om hun in vivo ROS opruiming activiteit tentoon te stellen. PNC worden gesynthetiseerd uit een mengsel van cerium nitraat- en PAA oplossing in ammoniak hydroxide. PNC worden gekenmerkt door absorptie spectrophotomery en de concentratie bepaald met behulp van bier-Lamberts wet. Zeta potentiële metingen bevestigd het negatief geladen oppervlak van PNC…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Universiteit van Californië, Riverside en USDA nationale Instituut voor voedsel en landbouw, Hatch project 1009710 J.P.G. Dit materiaal is gebaseerd op werk gesteund door de National Science Foundation onder Grant No. 1817363 aan J.P.G.
Materials
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
References
- Xu, C., Qu, X. Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).
- Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine. Antioxidants. 5 (2), 15 (2016).
- Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S. Controlling the surface chemistry of cerium oxide nanoparticles for biological applications. Journal of Materials Chemistry B. 4 (19), 3195-3202 (2016).
- Walkey, C., et al. Catalytic properties and biomedical applications of cerium oxide nanoparticles. Environ. Sci.: Nano. 2 (1), 33-53 (2015).
- Pulido-Reyes, G., et al. Untangling the biological effects of cerium oxide nanoparticles: the role of surface valence states. Scientific reports. 5, 15613 (2015).
- Dutta, P., et al. Concentration of Ce3+ and oxygen vacancies in cerium oxide nanoparticles. Chemistry of Materials. 18 (21), 5144-5146 (2006).
- Boghossian, A. A., et al. Application of nanoparticle antioxidants to enable hyperstable chloroplasts for solar energy harvesting. Advanced Energy Materials. 3, 881-893 (2013).
- Wu, H., Tito, N., Giraldo, J. P. Anionic cerium oxide nanoparticles protect plant photosynthesis from abiotic stress by scavenging reactive oxygen species. ACS Nano. 11 (11), 11283-11297 (2017).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nature Materials. 13 (4), 400-408 (2014).
- Demidchik, V. Mechanisms of oxidative stress in plants: From classical chemistry to cell biology. Environmental and Experimental Botany. 109, 212-228 (2015).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles impact yield and modify nutritional parameters in wheat (Triticum aestivum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (40), 9669-9675 (2014).
- Rossi, L., Zhang, W., Lombardini, L., Ma, X. The impact of cerium oxide nanoparticles on the salt stress responses of Brassica napus L. Environmental Pollution. 219, 28-36 (2016).
- Xu, J., Duan, X., Yang, J., Beeching, J. R., Zhang, P. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots. Plant Physiology. 161 (3), 1517-1528 (2013).
- Wu, H., et al. Developing and validating a high-throughput assay for salinity tissue tolerance in wheat and barley. Planta. , (2015).
- Pirmohamed, T., et al. Nanoceria exhibit redox state-dependent catalase mimetic activity. Chemical communications. 46 (16), 2736-2738 (2010).
- Asati, A., Santra, S., Kaittanis, C., Perez, J. M. Surface-charge-dependent cell localization and cytotoxicity of cerium oxide nanoparticles. ACS nano. 4, 5321-5331 (2010).
- Li, J., Wu, H., Santana, I., Fahlgren, M., Giraldo, J. P. Standoff optical glucose sensing in photosynthetic organisms by a quantum dot fluorescent probe. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2018).
- Wu, H., Shabala, L., Shabala, S., Giraldo, J. P. Hydroxyl radical scavenging by cerium oxide nanoparticles improves Arabidopsis salinity tolerance by enhancing leaf mesophyll potassium retention. Environmental Science: Nano. 5 (7), 1567-1583 (2018).
- Merad-Boudia, M., Nicole, A., Santiard-Baron, D., Saillé, C., Ceballos-Picot, I. Mitochondrial impairment as an early event in the process of apoptosis induced by glutathione depletion in neuronal cells: Relevance to Parkinson’s disease. Biochemical Pharmacology. 56 (5), 645-655 (1998).
- Zhao, H., et al. Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (16), 5727-5732 (2005).
- Sun, C., Li, H., Chen, L. Nanostructured ceria-based materials: synthesis, properties, and applications. Energy & Environmental Science. 5 (9), 8475 (2012).
- Hirano, M., Inagaki, M. Preparation of monodispersed cerium(iv) oxide particles by thermal hydrolysis: influence of the presence of urea and Gd doping on their morphology and growth. Journal of Materials Chemistry. 10 (2), 473-477 (2000).
- Xi, D. M., Liu, W. S., Yang, G. D., Wu, C. A., Zheng, C. C. Seed-specific overexpression of antioxidant genes in Arabidopsis enhances oxidative stress tolerance during germination and early seedling growth. Plant Biotechnology Journal. 8 (7), 796-806 (2010).
- Wu, H., Santana, I., Dansie, J., Vivo Giraldo, J. P. In Vivo delivery of nanoparticles into plant leaves. Current Protocols in Chemical Biology. 9 (4), 269-284 (2017).
- Fukushima, K., Hasebe, M. Adaxial-abaxial polarity: The developmental basis of leaf shape diversity. Genesis. 52 (1), 1-18 (2014).
- Monda, K., et al. Enhanced stomatal conductance by a spontaneous Arabidopsis tetraploid, Me-o, results from increased stomatal size and greater stomatal aperture. Plant physiology. 170 (3), 1435-1444 (2016).
- Petrov, V., Hille, J., Mueller-Roeber, B., Gechev, T. S. ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 1-16 (2015).
- Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).
