신호 분석 및 바이오 마커 발견 하는 단일 셀에 대 한 형광 셀 바코드와 인 Cytometry
Summary
여기, 세포 수준에서 단백질 인 산화 이벤트의 중간-높은 처리량 분석을 위한 프로토콜 제공 됩니다. 인 cytometry 신호 차 특성, 식별 바이오 마커, 유효성을 검사 하 고 pharmacodynamics를 평가 하는 강력한 접근 이다.
Abstract
벗어난 셀 신호 암 개발 및 진행에 중심 역할을 하고있다. 가장 새로운 표적으로 한 치료는 실제로 단백질 및 단백질 기능에서 감독과 셀 신호 착오 따라서 맞춤된 치료 옵션을 나타내는 생체 역할 수 있습니다. DNA와 RNA 분석, 반대로 변화 단백질 활동에 보다 효율적으로 기본 약물 감도 및 저항 메커니즘을 평가할 수 있다. 인 cytometry 단백질 인 산화 이벤트는 세포 수준에서 다른 항 체 기반 접근에서이 메서드를 구별 하는 중요 한 기능을 측정 하는 강력한 기술입니다. 메서드는 여러 신호 전달 단백질의 동시 분석에 대 한 수 있습니다. 형광 세포 바코드와 함께, 짧은 시간에 표준 cytometer 하드웨어에 의해 더 큰 매체-높은 처리량 데이터 집합을 취득 수 있습니다. 인 cytometry 응용 프로그램 기본 생물학의 연구와 임상 연구에서, 신호 분석, 바이오 마커 발견과 pharmacodynamics의 평가 포함 하 여 있다. 여기, 자세한 실험 프로토콜의 예를 들어 만성 림프모구 백혈병 세포를 사용 하 여 순화 된 말 초 혈액 단 세포 인 흐름 분석을 위해 제공 됩니다.
Introduction
인 cytometry는 단일 셀 해상도 단백질 인 산화 수준을 분석 하는 데 사용 됩니다. 방법의 전반적인 목표는 지정 된 조건에서 세포 신호 패턴을 지도. Cytometry multiparameter 용량을 이용 하 여 여러 신호 전달 경로 말 초 혈액 등 다른 유형의 세포 인구의 다른 하위 집합에 동시에 분석할 수 있습니다. 이러한 특성에는 다른 항 체 기반 기술 immunohistochemistry, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 단백질 배열 등 역 위상 단백질 배열 (RPPA)1에 비해 이점을 제공합니다. 인 cytometry 형광 세포 바코드 (FCB)를 함께 혼합, 스테인드 하 수 단일 샘플2분석 개별 셀 샘플 형광 염료의 독특한 서명으로 표시 됩니다 즉 결합 될 수 있다. 이 항 체 소비 감소, 제어 및 치료 샘플의 조합을 통해 데이터 안정성을 증가 하 고 수집의 속도 향상 시킵니다. 결합 된 FCB 인구 다음 작은 샘플을 나누어 하 고 최대 35 가지 인 특정 항 체, 시작 물자의 양에 따라 물 들일 수 있습니다. 대형 프로 파일링 실험, 표준 cytometer 하드웨어로 실행할 수 있습니다. 인 cytometry 만성 림프모구 백혈병 (CLL)3,,45, 급성 골수성 백혈병 (AML)을 포함 한 여러 혈액 암에서 환자 샘플에서 통로 신호 하는 프로 파일에 적용 된 6 과 비 Hodgkin 림프 종7. 인 cytometry 따라서 신호 차 특성, 식별 및 바이오 마커, 유효성 평가 하 pharmacodynamics 강력한 접근 이다.
여기, 인 cytometry에 의해 CLL 환자 샘플의 분석을 위해 최적화 된 프로토콜 (그림 1A) 제공 됩니다. 기저 신호 특성화, 안티-IgM/B 세포 수용 체 자극 및 약 섭 동 예 표시 됩니다. FCB 매트릭스에 대 한 자세한 설명이 제공 됩니다. 프로토콜은 쉽게 다른 현 탁 액 셀 형식에 적용할 수 있습니다.
Protocol
혈액 샘플은 모든 기증자 로부터 서 면된 동의 따라 접수 됐다. 연구는 의료 및 건강 연구 윤리의 남쪽-동쪽 노르웨이 지역 위원회에 의해 승인 되었다 하 고 인간의 피에 대 한 연구8헬싱키 선언 따라 실시 됐다. 참고: 1-3 단계 조직 문화 후드에서 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다. 1. 절연 CLL 환자 혈액 샘플에서 주변 혈?…
Representative Results
인 흐름 cytometry 프로토콜의 주요 단계는 그림 1A에 설명 됩니다. 제시 예에서 CLL 세포 4 희석에 바코드 시 약 태평양 블루와 스테인드 했다. 3 차원 바코드 그림 1B에서 볼 수 있듯이 3 barcoding 염료를 결합 하 여 수행할 수 있습니다. 개별 샘플은 다음 후속 게이팅 각 바코드 시 약 대 SSC-A (그림 1C)에 의?…
Discussion
인 cytometry 단 세포에 있는 단백질 인 산화 수준을 측정 하는 강력한 기술입니다. 때문에 항 체와 얼룩에 의존 하는 방법, 인 cytometry 항 체 여부에 의해 제한 됩니다. 또한, 신뢰할 수 있는 결과 얻으려면, 모든 항 체 적정와 있어야 사용 하기 전에 확인 합니다. 인 특정 항 체의 적정에 대 한 자세한 프로토콜 되었습니다12설명 되어. 패널 디자인, 신호 대 잡음 비율의 배려가 중요 합…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 교수 Kjetil Taskén의 실험실에서 실시 하 고 노르웨이 암 협회와 Stiftelsen 크리스티 앙 게르하르트 Jebsen에 의해 지원 되었다. 랜드 스크 론 요하네스와 마리 Enger 원고의 중요 한 독서에 대 한 인정 됩니다.
Materials
| RPMI 1640 GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10270169 | Additive to cell culture medium |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | Additive to cell culture medium |
| MEM non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | Additive to cell culture medium |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS | 1114547 | Density gradient medium |
| Anti-IgM | Southern Biotech | 2022-01 | For stimulation of the B cell receptor |
| BD Phosflow Fix Buffer I | BD | 557870 | Fixation buffer |
| BD Phosflow Perm Buffer III | BD | 558050 | Permeabilization buffer |
| Alexa Fluor 488 5-TFP | ThermoFisher Scientific | A30005 | Barcoding reagent |
| Pacific Blue Succinimidyl Ester | ThermoFisher Scientific | P10163 | Barcoding reagent |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | ThermoFisher Scientific | P30253 | Barcoding reagent |
| Compensation beads | Defined by user | Correct species reactivity | |
| Falcon tubes | Defined by user | ||
| Eppendorf tubes | Defined by user | ||
| 96 well V-bottom plates | Defined by user | Compatible with the flow cytometer | |
| Centrifuges | Defined by user | For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates | |
| Water bath | Defined by user | Temperature regulated | |
| Flow cytometer | Defined by user | With High Throughput Sampler (HTS) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen | |||
| AKT (pS473) | Cell Signaling Technologies | 4075 | Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| ATF-2 (pT71) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8398 | Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| BLNK (pY84) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558443 | Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY223)/Itk (pY180) | Beckton Dickinson Pharmingen | 564846 | Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Btk (pY551) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558129 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| Btk (pY551)/Itk (pY511) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558134 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| CD3ζ (pY142) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558489 | Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Histone H3 (pS10) | Cell Signaling Technologies | 9716 | Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| IκBα | Cell Signaling Technologies | 5743 | Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| LAT (pY171) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558518 | Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| Lck (pY505) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558577 | Clone: 4/LCK-Y505 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| MEK1 (pS298) | Beckton Dickinson Pharmingen | 560043 | Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| NF-κB p65 (pS529) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558422 | Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| NF-κB p65 (pS536) | Cell Signaling Technologies | 4887 | Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
| p38 MAPK (pT180/Y182) | Cell Signaling Technologies | 4552 | Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p44/42 MAPK (pT202/Y204) | Cell Signaling Technologies | 4375 | Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| p53 (pS15) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS20) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS37) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS46) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| p53 (pS392) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
| PLCγ2 (pY759) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558498 | Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| Rb (pS807/pS811) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558590 | Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| S6-Ribos. Prot. (pS235/236) | Cell Signaling Technologies | 4851 | Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SAPK/JNK (pT183/Y185) | Cell Signaling Technologies | 9257 | Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
| SLP76 (pY128) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558438 | Clone: J141-668.36.58 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
| STAT1 (pY701) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612597 | Clone: 4a Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT3 (pY705) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557815 | Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| STAT4 (pY693) | Zymed/ThermoFisher Scientific | 71-7900 | Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6 |
| STAT5 (pY694) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612599 | Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
| STAT6 (pY641) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612601 | Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
| SYK (pY525/Y526) | Cell Signaling Technologies | 12081 | Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
| ZAP70/SYK (pY319/Y352) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557817 | Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
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Citer Cet Article
Skånland, S. S. Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery. J. Vis. Exp. (140), e58386, doi:10.3791/58386 (2018).