포 르 말린 고정 암 조직 표본에 면역-종양학 연구를 위한 자동화 된 다중 면역 형광 패널
Summary
자세한 프로토콜 6-마커 멀티플렉스 면역 형광 패널 최적화 수행 위한 더 일관 된 결과를 짧은 절차 시간 자동된 염색기를 사용. 이 방법은 종양 면역 연구에 대 한 모든 실험실에 의해 직접 적응 될 수 있다.
Abstract
종양 면역에서에서 지속적인된 개발 암 면역학의 메커니즘의 증가 이해를 필요합니다. 포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 생 검에서 조직 샘플의 immunoprofiling 분석 종양 면역학의 복잡성을 이해 하 고 암 immunotherapy에 대 한 소설 예측 바이오 마커의 발견을 위한 주요 도구가 되고있다. Immunoprofiling 분석 조직 등 염증 성 세포 모집단 면역 검사, 종양 microenvironment에 결합 된 마커의 평가 필요 합니다. 소설 멀티플렉스 immunohistochemical 방법의 출현 보다 표준 수염 immunohistochemistry (IHC) 단일 조직 단면도의 더 효율적인 multiparametric 분석에 대 한 수 있습니다. 한 상용 멀티플렉스 면역 형광 (경우) 메서드는 tyramide 신호 증폭에 따라, multispectral 현미경 분석, 결합 조직에서 다양 한 마커의 더 나은 신호 분리에 대 한 수 있습니다. 이 방법론 표준 IHC FFPE 조직 샘플에 대 한 최적화 된 결합형된 기본 항 체의 사용과 호환 됩니다. 여기 우리가 자세하게에서 설명 멀티플렉스 수 있는 자동화 프로토콜 6-마커 다중 항 체 패널 구성 된 PD-L1, 암 조직 샘플의 라벨 경우 PD-1, CD68, CD8, 기-67, 및 4와 AE1/AE3 cytokeratins 6-diamidino-2-phenylindole 로 핵 셀 counterstain. 멀티플렉스 패널 프로토콜 착 시간을 수동 프로토콜의 보다 짧은 수 있습니다 직접 적용 고 인간의 FFPE 조직 샘플에 대 한 면역-종양학 연구에 대 한 모든 실험실 조사에 의해 적응에 대 한 자동된 IHC 염색기에 최적화 되어 있습니다. 또한 몇몇 컨트롤 및 도구, 새로운 다중 경우 패널의 좋은 품질 관리에 대 한 드롭-제어 방법을 포함 하 여 최적화 및 검증 기법에 대 한 유용한 있다.
Introduction
FFPE 종양 조직 샘플의 Immunoprofiling 분석 특히 발견 및 암 immunotherapy 임상 시험1의 맥락에 대 한 소설 예측 바이오 마커의 유효성 검사에 대 한 면역-종양학 연구의 필수 요소가 되고있다 ,2. 발 IHC, diaminobenzidine, 등 화학 chromogens를 사용 하 여 진단 병리학 생 검 조직의3의 immunolabeling에 대 한 표준 기술에 남아 있다. 표준 IHC 암 조직 immunoprofiling, 종양 관련 된 림프 톨의 부분 모집단 그리고 프로그램 된 세포 죽음 ligand 1 등 면역 검사점의 식 수준 평가 (PD-L1)4의 정량 등도 사용할 수 있습니다. ,5. 그러나 표준 IHC 제한 됩니다,, 그 하나의 항 원 조직 섹션 당 표시 될 수 있습니다. Immunoprofiling 연구는 일반적으로 여러 마커의 결합된 식의 분석 필요, 표준 IHC 사용 여러 조직 단면도의 얼룩이 지기 요구, 각 하나의 표식으로 물 될 것 이다, 실질적으로 중 핵 바늘 생 검 같은 작은 조직 샘플의 분석에 대 한 제한. 표준 IHC 방법 다양 한 세포 인구, PD L1, 종양 관련 된 대 식 세포와 암 세포에 의해 표현 된다와 같은 면역 검사점 마커로 일반적인 coexpressed 마커의 평가 대 한 제한도 있습니다. 이 제한에, 표준 수염 IHC의 사용 예를 들어, 다양 한 세포 유형6표현 IHC 마커의 정량 분석에 대 한 병리학 자에 의해 보고 되었습니다. 멀티플렉스 발 IHC 기술 채용 같은 조직 섹션 나타냅니다에 다양 한 컬러 chromogens 전진 표준 IHC 수염 방법,7 에 그들은 남아 있지만 개발의 불과 immunolabeling에 의해 제한 마커 또한 동일한 세포 인구의 동일한 subcellular 구획에서 표현 하는 마커의 적절 한 평가 위한 중요 한 기술 과제를 제시.
멀티플렉스 발 IHC 기법의 제한 뿐만 아니라 임상 샘플에서 조직 여부에 관한 상기 주의 에겐 있다 면역-종양학 연구 기반 향상 된 다중 방법을 개발 하는 필요 형광 라벨 결합 이미징 시스템을 효과적으로 동일한 슬라이드에서 여러 fluorophores의 신호를 분리할 수 있습니다. 1 개의 그런 기술은 tyramide 신호 증폭 (TSA) 효율적인 색상 분리8multispectral 현미경 이미징 결합을 기반으로 합니다. TSA 기반 상용 키트 사용 fluorophores multispectral 이미징8 최적화 ( 재료의 표참조). 이 시스템의 중요 한 이점은 이미 검증 되 고 표준 발 IHC9,,1011에 최적화 된 동일한 레이블 없는 기본 항 체와의 호환성 이다. 이 새로운 목표를 통합 최적화 및 패널 수정에서 빠른 최적화 뿐만 아니라 유연성 수 있습니다. 또한, 다중 면역 형광 검사 (mIF) TSA 메서드 수염에서 간단한 전송에 대 한 수 있도록 자동화 된 상용 IHC 염색기 시스템, 최적화 될 수 있습니다 비 IHC mIF.
여기 선물이 프로토콜 기반 면역-종양학 연구 mIF 패널 mIF TSA 얼룩 자동 고 이미징 multispectral 스캐너를 사용 하 여. 이 프로토콜 적응 고 설명된 계측 및 시 약에 대 한 액세스 있는 실험실 사용자에 의해 수정 될 수 있습니다. Carcinomas의 immunoprofiling에 대 한 6 주 항 체의 패널을 포함 하는 프로토콜: PD-L1, PD-1, CD68 (마커로 팬-대 식 세포), CD8 (세포 독성 T 세포), 기-67, 및 AE1/AE3 (팬 cytokeratin, 신분의 상피 표식으로 사용 암 세포)입니다. 최근 연구는 멀티 플렉스12얼룩을 확인 하기 위해 표준 참조로 발 IHC를 사용 하 여 수동 TSA mIF 프로토콜의 최적화를 설명 합니다. 여기에 제시 된 업데이트 메서드는 자동된 염색기, 크게는 착 시간 단축 3-5 일에서 14 h, 또한은 얼룩의 일관성을 향상 시키는 동시에 최적화 된 상용, 일곱 색 TSA 키트를 사용 하 여 개발 되었습니다. 여기에 제시 된 세부 주요 프로토콜 뿐만 아니라 보충 자료 섹션 포함 하는 “드롭-제어” 방법, 새 mIF 패널 뿐만 아니라, 최적화에 대 한 기술 노트를 평가 하는 추가적인 품질 관리 프로세스 문제 해결, 그리고 설정 하 고 사용자 정의 mIF 패널의 mIF TSA 방법 최적화 실험실 사용자 있도록 새로운 다중 패널의 개발.
Protocol
Representative Results
Discussion
지속적인 암 immunotherapy 혁명은 오프닝 소설과 유망 암 환자13에 대 한 치료 옵션. 면역-종양학 분야에서 발전 새로운 예측 생체를 찾을 뿐만 아니라 발암에 관여 하는 면역 메커니즘의 생물학을 이해 하는 것 뿐만 아니라 염증 성 종양 microenvironment의 증가 지식 필요 합니다. immunotherapy 기반 치료1,2. 때문에 암 면역학의 복잡 한 생물학, ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
편집 지원 MedImmune의 데보라 Shuman에 의해 제공 했다.
Materials
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient’s response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
- Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
- Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
- Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
- Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
- Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
- Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
- Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society’s standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
- Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), 16-18 (2016).
- Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
