Automatisert Multiplex Immunofluorescence Panel Immuno-onkologi studier på Formalin-fast Carcinoma vevsprøver
Summary
En detaljert protokoll for en seks-markør multiplex immunofluorescence panel er optimalisert og utført, med en automatisert fargemaskin for mer enhetlige resultater og kortere prosedyre tid. Denne tilnærmingen kan tilpasses direkte av noen laboratorium for immuno-onkologi studier.
Abstract
Videre utviklingen i immuno-onkologi krever en økt forståelse av mekanismer for kreft immunologi. Immunoprofiling analyse av vevsprøver fra formalin-fast, parafin-embedded (FFPE) biopsier har blitt et viktig verktøy for forstå kompleksiteten i svulst immunologi og oppdage romanen prediktiv biomarkers for kreft immunterapi. Immunoprofiling analyse av vev krever evaluering av kombinerte markører, inkludert inflammatorisk celle subpopulasjoner og immun sjekkpunkter, svulst microenvironment. Ankomsten av romanen multiplex immunohistochemical metoder gir en mer effektiv multiparametric analyse av enkelt vev enn standard monoplex immunohistochemistry (IHC). En kommersielt tilgjengelig multiplex immunofluorescence gir (hvis) metoden er basert på tyramide-signal forsterkning og kombinert med multispectral mikroskopisk analyse, en bedre signal separasjon av ulike markører i vev. Denne metodikken er kompatibel med bruk av unconjugated primære antistoffer som er optimalisert for standard IHC på FFPE vevsprøver. Her vi beskrive i detalj en automatisert protokoll som tillater multiplex hvis merking av karsinom med en seks-markør multiplex antistoff panel bestående av PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 og AE1/AE3 cytokeratins med 4, 6-diamidino-2-phenylindole som en kjernefysisk celle counterstain. Multiplex panelet protokollen er optimalisert i en automatisert IHC fargemaskin for gangen flekker som er kortere enn manuell protokollen og kan direkte brukes og tilpasset av noen laboratorium etterforsker for immuno-onkologi studier av menneskelig FFPE vevsprøver. Også beskrevet er flere kontroller og verktøy, inkludert en slipp-kontroll metoden for fine kvalitetskontroll av en ny multiplex hvis panel, som er nyttig for optimalisering og validering av teknikken.
Introduction
Immunoprofiling analyse av FFPE svulst er blitt en viktig del av immuno-onkologi studier, spesielt for oppdagelsen og validering av romanen prediktiv biomarkers for kreft immunterapi i sammenheng med kliniske forsøk1 ,2. Kromogent IHC, bruker kjemiske chromogens som diaminobenzidine, forblir standard teknikken i diagnostiske patologi for immunolabeling biopsi vev3. Standard IHC kan også brukes for kreft vev immunoprofiling, inkludert kvantifisering av subpopulasjoner av svulst-assosiert lymfocytter og vurdering av uttrykket immun sjekkpunkter som programmert celle død ligand 1 (PD-L1)4 ,5. Standard IHC er begrenset, men som eneste antigen kan merkes per vev delen. Fordi immunoprofiling studier vanligvis kreve analyse av kombinerte uttrykk for flere indikatorer, bruk av standard IHC ville kreve den flekker av vev inndelingene, hver farget med en enkelt penn, og vil derfor være betydelig begrenset for analyse av små vevsprøver som kjernen nål biopsier. Standard IHC metoder er også begrenset for vurdering av markører som er coexpressed av ulike celle populasjoner, som er vanlig med immun checkpoint indikatorer som PD-L1, som er uttrykt ved både svulst-assosiert makrofager og kreftceller. Denne begrensningen er rapportert i, for eksempel bruk av standard monoplex IHC av patologer for kvantitativ analyse av en IHC markør uttrykt av ulike cellen typer6. Utvikling av multiplex kromogent IHC teknikker ansette forskjellige fargede chromogens på samme vev delen representerer en fremgang over IHC monoplex standardmetoden,7 selv om de er begrenset av immunolabeling av noen markører og også presentere en viktig teknisk utfordring for riktig vurdering av markører i de samme subcellular deler av de samme celle populasjonene.
De nevnte begrensningene vev tilgjengeligheten fra klinisk prøver, i tillegg til begrensningene til multiplex kromogent IHC teknikker, har gitt opphav til behovet for å utvikle bedre multiplex metoder for immuno-onkologi studier basert på fluorescerende merking kombinert med imaging systemer som kan effektivt skille signaler om flere fluorophores fra samme lysbilde. En slik teknikk basert på tyramide signalforsterkning (TSA) kombinert med multispectral mikroskopi bildebehandling for effektiv farge separasjon8. En kommersielt tilgjengelig TSA-baserte kit benytter fluorophores optimalisert for multispectral tenkelig8 (se Tabell for materiale). En viktig fordel med dette systemet er kompatibilitet med samme umerkede primære antistoffer som allerede er validert og optimalisert for standard kromogent IHC9,10,11. Dette gir ikke bare raskere optimalisering, men også fleksibilitet i optimalisering og panel endringene omfatter nye mål. Videre multiplex immunofluorescence (mIF) TSA metoden kan optimaliseres for kommersielt tilgjengelig automatisert IHC fargemaskin systemer, slik at for en enkel overføring fra monoplex kromogent IHC til mIF.
Her presenterer vi en protokoll for en mIF panel for immuno-onkologi studier som er basert på automatiserte mIF TSA flekker og bruker en multispectral skanner for bildebehandling. Denne protokollen kan være tilpasset og endret av laboratoriet brukere med tilgang til beskrevet instrumentering og reagenser. Protokollen inneholder et panel av seks primære antistoffer for immunoprofiling av kreftsvulster: PD-L1, PD-1, CD68 (som en pan-macrophage markør), CD8 (cytotoksisk T celler), Ki-67 og AE1/AE3 (pan-cytokeratin, brukes som en epithelial markør for identifikasjon av karsinom celler). En fersk studie beskriver optimalisering av en manuell TSA mIF protokoll med kromogent IHC som en standard referanse for å validere multipleks flekker12. Oppdatert metoden som presenteres her er utviklet ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig, syv farger TSA kit optimalisert i en automatisert fargemaskin, drastisk redusere flekker tiden fra 3-5 dager til 14 h, samtidig forbedre konsistensen av den flekker. I tillegg til detaljert viktigste protokollen presenteres her, omfatter en Supplerende materiale delen metoden “slipp-kontroll”, en ekstra kvalitetskontroll prosessen å vurdere en ny mIF-panel, i tillegg til tekniske merknader for optimalisering, feilsøking og utvikling av nye multiplex paneler å laboratorium brukeren konfigurere og optimalisere metoden mIF TSA for tilpassede mIF paneler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pågående kreft immunterapi revolusjonen er åpning romanen og lovende behandlingsalternativer for kreft pasienter13. Fremskritt innen immuno-onkologi krever økt kunnskap om den inflammatoriske svulst microenvironment, ikke bare å forstå biologi immunologiske mekanismer involvert i kreft, men også å finne prediktiv biomarkers for nye immunterapi-baserte behandlinger1,2. På grunn av den komplekse biologien kreft immunologi, er avhør…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Redaksjonelle støtte ble levert av Deborah Shuman av MedImmune.
Materials
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient’s response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
- Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
- Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
- Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
- Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
- Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
- Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
- Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society’s standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
- Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), 16-18 (2016).
- Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
