عزل ثيلاكويدس النشطة فسيولوجيا واستخدامها في فحوصات البروتين الطاقة تعتمد على النقل
Summary
نقدم بروتوكولات هنا لعزل عالية الغلة من ثيلاكويدس النشطة فسيولوجيا وفحوصات البروتين النقل بلاستيدات الخضراء التوأم ارجينين إزفاء (كتات)، الافرازية (cpSec1)، وإشارة التعرف على مسارات الجسيمات (كبسرب).
Abstract
الجبيلة هي العضيات في النباتات الخضراء المسؤولة عن القيام بالعديد من الأيضية الأساسية، أبرزها عملية التمثيل الضوئي. ضمن المعايشة، النظام غشاء ثايلاكويد يضم جميع أصباغ التمثيل الضوئي ومجمعات مركز رد الفعل، ومعظم حاملات الإلكترون، وهي مسؤولة عن توليف ATP تعتمد على الضوء. أكثر من 90% بروتينات بلاستيدات الخضراء المشفرة في النواة ومترجمة في سيتوسول واستيرادها فيما بعد إلى بلاستيدات الخضراء. زيادة البروتين النقل إلى أو عبر غشاء ثايلاكويد يستخدم واحد من أربعة مسارات إزفاء. هنا، يمكننا وصف أسلوب عالية الغلة لعزل ثيلاكويدس النقل المختصة من البازلاء (بيسوم Pisum)، جنبا إلى جنب مع فحوصات النقل خلال الثلاث تعتمد على الطاقة كبتات و cpSec1، وكبسرب بوساطة مسارات. هذه الأساليب تمكن التجارب المتصلة بالتعريب البروتين ثايلاكويد وعلم الطاقة النقل آليات إزفاء البروتين عبر الأغشية البيولوجية.
Introduction
يجب أن يكون ترانسلوكاتيد ما يقرب من جميع البروتينية الآلية المسؤولة عن وظيفة بلاستيدات الخضراء المناسبة من سيتوسول1. في المغلفات بلاستيدات الخضراء، يتم استيراد ركائز البروتين من خلال ترانسلوكون الغشاء الخارجي (TOC) وترانسلوكون من الغشاء الداخلي (عرة)2. مواصلة استهداف ثايلاكويد غشاء والتجويف يحدث خلال إزفاء (كتات) ارجينين التوأم3و الافرازية (cpSec1)4، إشارة اعتراف الجسيمات (كبسرب)5ومسارات الإدراج التلقائي6 . طريقة لعزل عالية الغلة المعايشة النشطة فسيولوجيا والأغشية ثايلاكويد ضروري لقياس علم الطاقة وحركية الحدث إزفاء، فهم آليات النقل المتنوعة في كل مسار، وتعريب بروتين معين الركيزة لمصلحة أي من المقصورات متميزة ستة من بلاستيدات الخضراء.
عزل أغشية من بلاستيدات الخضراء عروض أفضل التجريبية السيطرة على العوامل البيئية (مثل تركيزات الملح والركيزة، ووجود ATP/غتب، وظروف الأس الهيدروجيني) التي تؤثر على قياس النقل علم الطاقة و حركية. هذه البيئة في المختبر يفسح المجال لاستكشاف تفاصيل إزفاء آليا لنفس الأسباب. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما تحسنت البرمجيات التنبؤية لتعريب بروتينات بلاستيدات الخضراء7،8، في المختبر فحوصات النقل توفر طريقة أسرع لتأكيد عبر فحوصات الفلورسنت المستندة إلى الفحص المجهري أن تتطلب علامة نيون وراثيا مرمزة، تحول النباتات و/أو أجسام مضادة محددة. نقدم هنا، بروتوكولات للعزلة بلاستيدات الخضراء وثايلاكويد من البازلاء (بيسوم بسام)، وكذلك لفحوصات النقل الأمثل لكل من المسارات إزفاء ثايلاكويد المعتمدة على الطاقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
عزل بلاستيدات الخضراء وثايلاكويد
يمكن أن يؤدي إلى الكسر المفرط في بلاستيدات الخضراء الفقراء العزل ومن ثم ثايلاكويد الفقيرة تسفر عن بعد الانفصال في التدرج. فمن الأفضل مجانسة الأنسجة المقطوع بلطف بضمان أن جميع المواد هي غارقة قبل المزج والنبض في 15 ثانية دورات حتى تجانس تماما. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أعدت هذه المخطوطة مع التمويل من شعبة العلوم الكيميائية وعلوم الأرض، والعلوم البيولوجية، مكتب 408 من علوم الطاقة الأساسية “إدارة الطاقة الأمريكية” عن طريق المنح دي-SC0017035
Materials
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
References
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).
- Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. Protein transport into chloroplasts. Annual review of plant biology. 61, (2010).
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
- Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
- Dabney-Smith, C., Storm, A. . Plastid Biology. , 271-289 (2014).
- Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
- Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).
- Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).
- Lo, S. M., Theg, S. M. . Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).
- Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
- Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
- Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
- Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
- Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
- Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
- Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
- Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
- Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
- Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
- Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Biochimie. 43 (45), 14508-14516 (2004).
- Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
- Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).
