Isolering af fysiologisk aktive tylakoiderne og deres anvendelse i energiafhængige Protein Transport Assays
Summary
Vi præsenterer protokoller heri til højtydende isolation af fysiologisk aktive tylakoiderne og protein transport assays til grønkorn twin arginin translokation (cpTat), sekretorisk (cpSec1) og signal anerkendelse partikel (cpSRP) veje.
Abstract
Kloroplaster er organelles i grønne planter forestår mange væsentlige stofskifteveje, især fotosyntese. I grønkornene, tylakoid membran system huse alle de fotosyntetiske pigmenter, reaktion center komplekser og de fleste af elektron luftfartsselskaber, og er ansvarlig for lys-afhængige ATPsyntesen. Over 90% af grønkorn proteiner er kodet i kernen, oversat i cytosol og efterfølgende importeres til chlorplasttransitpeptidsekvensen. Yderligere protein transport ind eller tylakoidmembranen udnytter en af fire translokation veje. Her, beskriver vi en højtydende metode til isolation af transport-kompetente tylakoiderne fra ærter (Pisum sativum), sammen med transport assays gennem tre energiafhængige cpTat, cpSec1 og cpSRP-medieret veje. Disse metoder aktiverer eksperimenter vedrørende tylakoid protein lokalisering, transport energetik og mekanismer for protein translokation over biologiske membraner.
Introduction
Næsten alle de proteinholdige maskiner ansvarlig for korrekt grønkorn funktion skal omplantes fra cytosol1. På grønkorn konvolutter, er protein substrater importeret gennem translocon af den ydre membran (TOC) og translocon i den indre membran (TIC)2. Yderligere målretning til tylakoid sker membran og lumen gennem twin arginin translokation (cpTat)3, sekretorisk (cpSec1)4, signal anerkendelse partikel (cpSRP)5og spontane indsættelse veje6 . En metode til højtydende isolering af fysiologisk aktive grønkorn og tylakoid membraner er nødvendigt at måle energetik og kinetik af en translokation begivenhed, at forstå de forskellige transportmekanismer på hver vej og lokalisere en bestemt protein substrater af interesse for nogen af de seks særskilte rum af chlorplasttransitpeptidsekvensen.
Isolering af membraner fra chlorplasttransitpeptidsekvensen tilbyder bedre eksperimentelle kontrol over miljømæssige faktorer (såsom salt og substrat koncentrationer, tilstedeværelsen af ATP/GTP og pH betingelser), der påvirker målingen af transport energetik og kinetik. Denne in vitro- miljø egner sig til udforskning af mekaniske detaljer af translokation af de samme grunde. Desuden, mens intelligent software til lokalisering af grønkorn proteiner har forbedret7,8, giver in vitro- transport assays en hurtigere metode til bekræftelse over mikroskopi-baserede fluorescerende assays kræve en genetisk kodet fluorescerende tag, plante transformation og/eller specifikke antistoffer. Vi præsenterer her, protokoller for grønkorn og tylakoid isolering fra ærter (Pisum sativum) samt for transport assays optimeret til hver af de energi-afhængige tylakoid translokation veje.
Protocol
Representative Results
Discussion
Grønkorn og tylakoid isolation
Overdreven brud kan resultere i dårlig grønkorn isolation og dermed dårlig tylakoid udbytte efter separation i farveforløbet. Det er bedst at homogenisere de høstede væv forsigtigt ved at sikre, at alt materiale er neddykket før blanding og pulserende i 15 s cykler indtil fuldt homogeniseret. Hvis det er nødvendigt, bruge flere kortere runder af blanding med mindre væv i hver runde.
Køle alle materialer, der kommer i kontakt me…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette håndskrift blev udarbejdet med finansiering af Division af kemiske videnskaber, Geosciences og biovidenskab, 408 Office af energi Grundvidenskab af os Department of Energy gennem Grant DE-SC0017035
Materials
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
References
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).
- Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. Protein transport into chloroplasts. Annual review of plant biology. 61, (2010).
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
- Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
- Dabney-Smith, C., Storm, A. . Plastid Biology. , 271-289 (2014).
- Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
- Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).
- Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).
- Lo, S. M., Theg, S. M. . Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).
- Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
- Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
- Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
- Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
- Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
- Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
- Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
- Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
- Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
- Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
- Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Biochimie. 43 (45), 14508-14516 (2004).
- Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
- Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).
