Isolamento de fisiologicamente ativo contém e a sua utilização em ensaios de transporte de energia-dependente da proteína
Summary
Apresentamos os protocolos neste documento para isolamento de alto rendimento de fisiologicamente ativo contém e ensaios de transporte da proteína para a translocação de arginina gêmeo cloroplasto (cpTat), secretora (cpSec1) e percursos de partícula (cpSRP) de reconhecimento de sinal.
Abstract
Cloroplastos são as organelas em plantas verdes responsáveis pela realização de inúmeras vias metabólicas essenciais, mais notavelmente a fotossíntese. Dentro do cloroplasto, o sistema de membrana tilacoides abriga todos os pigmentos fotossintéticos, complexos de centro de reação e a maioria dos transportadores de elétrons e é responsável pela síntese de ATP de luz-dependente. Mais de 90% das proteínas do cloroplasto são codificados no núcleo, traduzido no citoplasma e posteriormente importada para o cloroplasto. Transporte de proteína adicional em ou através da membrana tilacoides utiliza uma das quatro vias de translocação. Aqui, descrevemos um método de alto rendimento para isolamento de transporte-competente contém de ervilhas (Pisum sativum), juntamente com ensaios de transporte através de três cpTat de energia-dependente, cpSec1 e vias mediada por cpSRP. Estes métodos permitem experiências relacionadas com a localização da proteína tilacoides, transporte energética e os mecanismos de translocação de proteínas através das membranas biológicas.
Introduction
Quase todas as máquinas proteicas responsável pela função de cloroplasto adequada devem ser translocadas no citosol1. Os envelopes do cloroplasto, substratos de proteína são importados através do translocon da membrana exterior (TOC) e o translocon da membrana interna (TIC)2. Mais direcionamento para os tilacoides membrana e lúmen ocorre através do gêmeo arginina translocação (cpTat)3, a secretora (cpSec1)4, o sinal de reconhecimento das partículas (cpSRP)5e as vias de inserção espontânea6 . Um método para a isolação de alto rendimento de cloroplastos fisiologicamente ativos e membranas tilacoides é necessário medir a energética e cinética de um evento de translocação, compreender os mecanismos de transporte diversa em cada percurso e localizar uma substrato específico da proteína de interesse para qualquer um dos seis compartimentos distintos do cloroplasto.
O isolamento das membranas do cloroplasto oferece melhor experimental controle sobre fatores ambientais (tais como concentrações de sal e substrato, a presença de ATP/GTP e condições de pH) que afetam a medição da energética de transporte e cinética. Este ambiente em vitro presta-se à exploração dos detalhes mecanicistas de translocação, pelas mesmas razões. Além disso, enquanto o software preditivo para localização de proteínas cloroplasto melhorou7,8, ensaios de transporte em vitro fornecem um método mais rápido para confirmação sobre baseado em microscopia fluorescentes ensaios que exigem uma etiqueta fluorescente geneticamente codificada, planta de transformação e/ou anticorpos específicos. Aqui, apresentamos protocolos para isolamentos de cloroplasto e tilacoides de ervilhas (Pisum sativum), bem como para os ensaios de transporte otimizados para cada uma das vias de translocação de tilacoides de energia-dependente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolamento de cloroplasto e tilacoides
Quebra excessiva pode resultar em cloroplasto pobre isolamento e, portanto, pobre tilacoides rendimento após a separação do degradê. É melhor homogeneizar o tecido colhido suavemente, garantindo que todo o material está submersa antes de mesclagem e pulsação em 15 ciclos s até totalmente homogeneizado. Se necessário, use vários tiros mais curtos de mistura com menos tecido em cada rodada.
Todos os materiais que entram e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este manuscrito foi preparado com financiamento pela divisão de ciências químicas, Geociências e Biociências, 408 escritório de ciências básicas da energia do departamento de energia através DE Grant-SC0017035
Materials
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
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