Isolering av fysiologiskt aktiva Thylakoids och deras användning i energi-beroende Protein Transport analyser
Summary
Vi presenterar protokoll häri för högavkastande isolering av fysiologiskt aktiva thylakoids och protein transport analyser för kloroplast twin arginin translokation (cpTat), sekretoriska (cpSec1) och signalvägar erkännande partikel (cpSRP).
Abstract
Kloroplaster är organeller i gröna växter ansvarar för att utföra många viktiga metaboliska vägar, främst fotosyntes. Inom kloroplaster, tylakoida membran systemet inrymmer alla fotosyntetiserande pigment, reaktion centrerar komplex och de flesta av de elektron bärarna, och ansvarar för light-dependent ATP-syntes. Över 90% av kloroplast proteiner är kodade i kärnan, översatt i cytosolen och därefter importeras till kloroplast. Ytterligare proteintransport in i eller över det tylakoida membranet använder en av fyra translokation vägar. Här beskriver vi en högavkastande metod för isolering av transport-behöriga thylakoids från ärter (Pisum sativum), tillsammans med transport analyser genom tre energiberoende cpTat, cpSec1 och cpSRP-medierade vägar. Dessa metoder gör det möjligt för experiment som avser tylakoida protein lokalisering, transport Energetik och mekanismerna för protein flyttning över biologiska membraner.
Introduction
Nästan alla av proteinhaltiga maskiner ansvarar för korrekt kloroplast funktion måste vara flyttad från cytosolen1. På kloroplast kuverten importeras protein substrat genom translocon av det yttre membranet (TOC) och translocon av inre membranet (TIC)2. Ytterligare inriktning till tylakoida sker membranet och lumen genom twin arginin translokation (cpTat)3, den sekretoriska (cpSec1)4, signal erkännande partikel (cpSRP)5och den spontana införande vägar6 . En metod för högavkastande isolering av fysiologiskt aktiva kloroplaster och tylakoida membran är nödvändigt att mäta de energetiken och kinetik av en translokation händelse, att förstå de olika transportmekanismer i varje väg, och att lokalisera en visst protein substrat av intresse för någon av de sex skilda fack för kloroplast.
Isolering av membran från kloroplast erbjuder bättre experimentell kontroll över miljöfaktorer (t.ex. salt och substrat koncentrationer, förekomsten av ATP/GTP och pH förhållanden) som påverkar mätningen av transport Energetik och kinetik. Denna in vitro- miljö lämpar sig för utforskandet av mekanistiska detaljerna av flyttning av samma skäl. Dessutom, medan predikterande mjukvara för lokalisering av kloroplast proteiner har förbättrats7,8, ger in vitro- transport analyser en snabbare metod för bekräftelse över mikroskopi-baserade fluorescerande analyser som kräver en genetiskt kodade fluorescerande tagg, växt förvandling och/eller specifika antikroppar. Här presenterar vi protokoll för kloroplast och tylakoida isoleringar från ärter (Pisum sativum), samt för transport analyser optimerad för var och en av energiberoende tylakoida flyttning vägar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kloroplast och tylakoida isolering
Överdriven brott kan resultera i dålig kloroplast isolering och därmed dålig tylakoida avkastning efter separation i övertoningen. Det är bäst att homogenisera skördade vävnaden försiktigt genom att säkerställa att allt material är nedsänkt innan blandning och pulserande i 15 s cykler tills fullt homogeniseras. Om nödvändigt, använda flera kortare rundor av blandning med mindre vävnad i varje omgång.
Kyl alla materi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta manuskript var beredd med finansiering av Division of Chemical Sciences, geovetenskaper och biovetenskaper, 408 Office för grundläggande Energivetenskaper av oss Department of Energy genom Grant DE-SC0017035
Materials
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
References
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).
- Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. Protein transport into chloroplasts. Annual review of plant biology. 61, (2010).
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
- Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
- Dabney-Smith, C., Storm, A. . Plastid Biology. , 271-289 (2014).
- Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
- Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).
- Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).
- Lo, S. M., Theg, S. M. . Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).
- Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
- Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
- Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
- Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
- Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
- Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
- Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
- Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
- Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
- Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
- Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Biochimie. 43 (45), 14508-14516 (2004).
- Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
- Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).
