Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için
Summary
Burada, hızlı bir şekilde yüksek kaliteli çekirdekleri aşağı akım kitlesel paralel RNA sıralama için taze veya dondurulmuş dokusundan izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut. İkisi de çekirdek yalıtımı için kullanılan deterjan-mekanik ve mekanik hipotonik doku bozulma ve hücre lizis seçenekleri, içerir.
Abstract
Tek bir hücre’nın gen ekspresyonu sondalama hücre tipi ve hücre devlet sağlar. Tek hücreli RNA sıralama transkripsiyon profilleri hücrelerinin, merkezi sinir sistemi gibi heterojen dokuları özellikle eğitim için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Ancak, tek hücre sıralama için gereken ayrılma yöntemleri gen ifade ve hücre ölümünde deneysel değişikliklere yol açabilir. Ayrıca, bu yöntemler genellikle böylece arşivleme üzerine çalışmalar ve biyo-banka malzeme sınırlama taze doku için kısıtlanır. Tek çekirdek RNA sıralama (snRNA-Seq) transkripsiyon çalışmaları, verilen bu doğru hücre tipleri tanımlar, donmuş ya da ayırmak zor doku çalışma ruhsatı için çekici bir alternatifi ve ayrılma kaynaklı azaltır Transkripsiyon. Burada, yüksek üretilen iş iletişim kuralı çekirdeği aşağı akım snRNA-devamı için hızlı yalıtım için mevcut Bu yöntem çekirdeği taze veya dondurulmuş omurilik örneklerinden yalıtım sağlar ve iki kitlesel paralel damlacık kapsülleme platformları ile kombine edilebilir.
Introduction
Sinir sistemi hànzú morfolojik, biyokimyasal ve elektrofizyolojik özellikleri çeşitli bir dizi görüntüleyen hücreler kümesinden oluşur. Süre toplu RNA sıralama gen ekspresyonu farklı koşullar altında doku genelindeki değişiklikleri belirlemek için yararlı olmuştur, transkripsiyon değişiklikleri tek hücre düzeyinde algılanması engellemektedir. Tek hücreli transkripsiyon analiz son gelişmeler hànzú hücreleri sınıflandırması moleküler kendi repertuar göre fonksiyonel gruplara etkinleştirdiyseniz ve hatta son zamanlarda aktif nöron kümeleri bulmak için kullanılacak olabilir. 1 , 2 , 3 , 4 son on yıl içinde gen ifadesinde bir görünüme hücre tipi çeşitlilik sağlayan tek tek hücreler, çalışma tek hücre RNA (scRNA-Seq) sıralama gelişimini sağlamıştır. 5
Gibi kitlesel paralel scRNA-Seq, ölçeklenebilir yaklaşımlar ortaya çıkması sıra heterojen dokulara, merkezi sinir sistemine sahip pek çok bölge de dahil olmak üzere platformlar sağlamıştır. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 ancak, tek hücre ayrılma yöntemleri gen ifadesinde deneysel değişikliklerin yanı sıra hücre ölümüne yol açabilir. 16 tek hücre sıralama yöntemleri endojen transkripsiyon profilleri korunması etkinleştirmek için son çalışmasını benimsemiştir. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 bu stratejileri hemen erken gen (IEG) ifade duyusal uyarıcı veya davranış aşağıdaki algılamak için özellikle uygun olmuştur. 3 , 4 gelecekte, bu strateji de dokularda hastalık durumlarında veya strese yanıt dinamik değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Bu yöntemleri, tek çekirdek RNA sıralama (snRNA-Seq) hücre ayrılma stres-inducing içermeyen ve zor doku (örneğin, spinal kord) ayırmak için yanı sıra dondurulmuş kullanılabilir bir umut verici yaklaşımdır doku. 4 , 17 , 18 , 19 uyarlama önceki çekirdek izolasyon yöntemleri,20,21,22,23,25 snRNA-Seq genellikle hızlı doku bozulması ve hücre kullanır lizis soğuk koşulları, Santrifüjü ve ayrılık çekirdeği, hücresel enkaz altında. 4 çekirdek çoklu mikrosıvısal damlacık kapsülleme platformlarda aşağı akım nesil sıralama için ayrılmış olabilir. 4 , 7 , 24 , 25 bu yöntem bir anda zaman içinde binlerce hücre transkripsiyon etkinliği bir anlık görüntü için izin verir.
Çekirdeklerin hücrelerden yalıtım ve sıralama, her biri kendi avantajları ve dezavantajları önce serbest bırakmak için birden çok strateji vardır. Burada, biz tanımlamak ve aşağı akım kitlesel paralel snRNA Seq için yetişkin omurilik üzerinden çekirdek yalıtım etkinleştirmek için iki protokol karşılaştırın: deterjan-mekanik lizis ve mekanik hipotonik lizis. Deterjan-mekanik lizis tam doku bozulması ve çekirdekleri daha yüksek bir son verim sağlar. Hipotonik mekanik-lysis doku bozulması, miktar ve saflık son nükleer verim arasında bir denge seçmek için bir fırsat sağlayan kontrol edilebilir bir ölçüde içerir. Bu yaklaşımlar karşılaştırılabilir RNA verim, çekirdek ve hücre tipi profil başına genlerin algılanan numaraları sağlar ve aynı zamanda her ikisi de başarılı bir şekilde snRNA-devamı için kullanılabilir
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı, nihai hedefi aşağı akım transkripsiyon analiz için yüksek kaliteli RNA içeren çekirdeklerin izole etmektir. SnRNA-Seq yöntemleri tüm hücre tiplerinin spinal kord profil için uyarlanmış. Başlangıçta, biz omurilik sinir hücreleri hücre ölümü için özellikle savunmasız olduğu gibi tipik hücre ayrılma yöntemleri tek hücre RNA sıralama için etkisiz bulundu. Ayrıca, hücre ayrılma yöntemleri hundred-fold kadar birçok çeşitli etkinlik ve stres tepkisi genler tarafından…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NINDS Intramural programı tarafından desteklenmiştir (1 ZIA NS003153 02) ve NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Biz L. Li ve onların teknik destek ve yararlı tartışmalar için CI Dobrott ve C. Kathe el yazması gözden geçirme için teşekkür ederim.
Materials
| Sucrose | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M1028-10X1ML | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Add DTT just prior to use |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504-044 | |
| 1X PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Glass Tissue Dounce (2 ml) | Kimble | 885303-002 | |
| Glass large clearance pestle | Kimble | 885301-0002 | |
| Glass small clearance pestle | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
| Dispersing tool (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Conical tubes | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
| Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Corning | 353002 |
References
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
- Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
- Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022 (2016).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- . Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018)
- 10X Genomics. . Single Cell 3′ Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
- Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
- Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
