Rensing av ekstracellulære Trypanosomes, inkludert afrikansk, fra blod av Anion-vekslere (Diethylaminoethyl innen kolonner)
Summary
Denne metoden trypanosome separasjon fra blod avhenger sine overflaten kostnader blir mindre negativ enn blod pattedyrceller. Infisert blod er plassert og behandlet på en anion-veksler kolonne. Denne metoden, den mest passende diagnose på Sovesyke, gir immunologiske, biologiske, biokjemiske, farmasøytisk og molekylærbiologi undersøkelser renset parasitter.
Abstract
Denne metoden tillater separasjon av trypanosomes, parasitter ansvarlig for dyr og menneskelige Sovesyke (HAT), fra infisert blod. Dette er den beste metoden for diagnostisering av første etappe lue og videre denne parasite rensing metoden tillater serologisk og forskning undersøkelser.
HAT er forårsaket av Tsetse fly overført Trypanosoma brucei gambiense og T. b. rhodesiense. Relaterte trypanosomes er den forårsaker agenter av dyr trypanosomiasis. Trypanosome påvisning er viktig for HAT diagnose, behandling og oppfølging. Teknikken er beskrevet her er det mest sensitive parasitten oppdagelsen teknikken, tilpasset feltforhold for diagnostisering av T. b. gambiense lue og kan fullføres innen én time. Blod er lagdelt på en anion-veksler kolonne (DEAE cellulose) tidligere justert til pH 8, og elueringsbufferen er lagt. Svært negativt ladde blod celler er adsorbert på kolonnen mens de mindre negativt ladde trypanosomes passerer gjennom. Samlet trypanosomes pelleted med sentrifugering og observert av mikroskopi. Videre er parasitter utarbeidet uten cellular skade samtidig som deres infectivity.
Renset trypanosomes kreves for immunologiske testing; de brukes i trypanolysis analysen, gullstandarden i HAT serologi. Farget parasitter benyttes i kortet agglutinerende test (CATT) for feltet serologi. Antigener fra renset trypanosomes, som variant overflaten glykoprotein, exoantigens, brukes også i ulike immunanalyser. Fremgangsmåten som er beskrevet her er beregnet for afrikanske trypanosomes; Følgelig må kromatografi forholdene tilpasses til hver trypanosome stamme, og mer generelt, blod hver art av verten pattedyr.
Disse fascinerende patogener er lett renset og tilgjengelig for bruk i biokjemiske, molekylære og cellen biologi studier inkludert co kultur med verten cellene til å undersøke vert-parasitten relasjoner på nivå med membran reseptorer, signalisering og genet uttrykk. Drug testing i vitro; undersøkelse av genet sletting, mutasjon eller overuttrykte på metabolske prosesser, cellen cytoskjelett biogenesis og parasitten overlevelse.
Introduction
Metoden presentert beskrevet her kan separasjon av trypanosomes, ansvarlig for dyr og menneskelige Sovesyke (HAT), blod parasitter. Dette er den beste metoden for diagnostisering av første etappe lue og videre denne parasite rensing metoden tillater robust serologisk og forskning etterforskning.
HAT er forårsaket av Tsetse fly overført Trypanosoma brucei gambiense og T. b. rhodesiense1. Parasittene protozoan multiplisere extracellularly i blodet, lymfe og interstitiell væske under den første fasen av sykdommen (hemolymphatic scenen). Den andre fasen (meningoencephalitic scenen) begynner når parasitter krysser blod-hjernebarrieren; nevrologiske tegn, inkludert en søvnforstyrrelse, som har gitt sitt navn “Sovesyke” denne sykdommen, er typisk for denne andre fase2. Relaterte trypanosomes (T. evansi, T. congolense, T. Samsung, T. b. brucei) er den utløsende agenter dyr afrikanske trypanosomosis (AAT)3.
World Health Organization (WHO) har som mål å eliminere HATTEN som et folkehelseproblem 2020 og unngå overføring av 20304. Den nylige lanseringen av rask diagnose tester har forbedret serologisk diagnose1,4,5. Flere molekylær diagnostiske tester har blitt utviklet, men deres rolle i feltet diagnostikk er ennå ikke etablert5. De brukes til å identifisere underarter av brucei grupper og atypiske trypanosomiasis skyldes parasitter ansvarlig for dyr trypanosomosis6.
Gjenkjenning av parasitten er viktig for diagnostisering, behandling og oppfølging, som serologi kan gi falske positive og dessverre falske negative resultater1. Direkte microscopical observasjon av disse hemoflagellate er vanskelig i HAT saker som er forårsaket av T. b. gambiense, (mer enn 95% av tilfellene) som lav parasitemias er regelen, mens for HAT forårsaket av T. b. rhodesiense, en stor antall parasitter er ofte tilstede i blodet. Ulike konsentrasjon teknikker har blitt brukt og tykk drop og kapillær tube sentrifugering (CTC), men separasjon av parasitter fra blod fra en kolonne av anion-veksler (DEAE cellulose) etterfulgt av sentrifugering og mikroskopiske observasjon av den pellets, er den mest sensitive metoden (rundt 50 parasitter/mL blod kan oppdages)1,7. Følgelig rensing av trypanosomes av denne anion-vekslere (DEAE cellulose) metoden er best, og til dags dato, metoden referanse for å visualisere og isolere parasitter fra blod for HAT diagnose. I feltforhold, en mini kolonne med DEAE cellulose har blitt brukt og flere forbedringer har tilrettelagt microscopical observasjon7,8.
Metoden trypanosome atskillelse fra blod, beskrevet nedenfor, avhengig av parasitten overflaten kostnad, som er mindre negativ enn blod pattedyrceller9. Interessant, denne metoden ble utviklet 50 år siden, i 1968 av Dr. Sheila Lanham, og fortsatt gullstandarden for deteksjon og utarbeidelse av blodet trypanosomes. Det er raskt og reproduserbar for salivarian trypanosomes fra et bredt spekter av pattedyr, tillater diagnostisering av både dyr og menneskelige trypanosomiasis10.
For å få levende, renset parasitter, er infisert blod lagt inn på en anion-veksler kolonne. Kromatografi forhold (hovedsakelig pH, ionisk styrke av buffere/media) må tilpasses til hver trypanosome arter, og mer generelt, til hver blanding av pattedyr blodceller og trypanosomes10. Elueringsbufferen justeres nøyaktig til pH 8 for de fleste afrikanske trypanosomes10. Denne metoden favoriserer konsentrasjonen av parasitter som finnes i blodet av pasienter, fordi parasitemias kan være for lav til å bli oppdaget av mikroskopiske observasjon alene, og det gjør også laboratorieundersøkelser. Arbeide med fersk isolerte trypanosomes og blod fra infiserte dyr, bruker denne teknikken, er mer relevant for ulike undersøkelser enn studier med parasitter som har vært kultivert i axenic forhold i laboratoriet på ubestemt tid.
Host-parasitten relasjoner er best studerte med en parasitt infeksjon naturlig verten, derfor T. musculi, en naturlig murine parasitten, som er representant for ekstracellulære trypanosomes, har mange fordeler som murine infeksjon innebærer i en lite laboratorium dyr og krever ikke biohazard sikkerhetsforhold nivå (BSL). T. musculi dreper ikke immunkompetente mus, i motsetning til mange andre Trypanosoma arter, inkludert mennesker. T. musculi er ikke eliminert i T celle-belastede mus og parasitemias kan økes i infiserte mus ved å endre mat og næringsstoff inntak11. Denne parasitten modulerer immunrespons i co infeksjoner med12andre patogener. T. musculi fra infiserte mus utstillingen forskjeller fra kulturperler T. musculi, for eksempel uttrykk for membran Fc reseptorer er tapt i T. musculi axenic kulturer, sammenlignet med parasitter renset fra infiserte mus13 , 14. Excreted-utskilles faktorer (ESF) er også kvalitativt og kvantitativt mindre uttrykt i axenic trypanosome kulturer og forskjellige stammer isolert i endemiske områder15. ESF er de første antigener vises for immunforsvaret vert og så spille en viktig rolle i første verten immunrespons16.
I eksperimentelt infiserte dyr for laboratorieundersøkelser forenkler denne protokollen eksperimenter på et større antall parasitter, minimere antall mus kreves særlig når benytter svekket immunapparat dyr. De varianten overflate glykoproteiner (VSGs) som brukes i kortet agglutinerende testen for Trypanosomiasis (CATT) i masse screening er fortsatt renset fra trypanosomes som gjennomføres i rotter. De to rask diagnostiske testene (individuelt pakket kassetter) som er nå tilgjengelig for bruk i feltet fortsatt bruker en infeksiøs modell kilde til opprinnelig VSGs og ikke i vitro kultivert trypanosomes1,4, 5. fremme i studiet av trypanosome immunologi og biologi har blitt lettere siden disse DEAE cellulose renset parasitter kan lett få store mengder fra naturlig eller eksperimentelt infiserte verter og spesielt gnagere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Renset trypanosomes representerer en kraftig måte å studere immunologi, biokjemi, mobil og molekylærbiologi. Store flater og resultatene er anskaffet fra trypanosomes, som deretter har bidratt til å hente informasjon fra andre eukaryotic celler30. Trypanosomes er også gjenstand for viktig og interessant forskning fordi de har utformet flere mekanismer som tillater dem å overleve og vokse i to svært forskjellige miljøer: tsetse fly vektoren og pattedyr vert23,</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle medlemmer av UMR 177 INTERTRYP IFU CIRAD Université de Bordeaux. Denne forskningen ble støttet av interne finansiering fra Universitetet i Bordeaux og støtte fra ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, og fra Association pour le développement de la recherche no parasitologie et médecine tropicale og tjenesten de coopération et d’action culturelle de l’Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).
Materials
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
References
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review. Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).
- Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).
- Büscher, P., Deborggraeve, S. How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).
- Truc, P., et al. Atypical human infections by animal trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).
- Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).
- Büscher, P., et al. Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).
- Lanham, S. M. Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).
- Lanham, S. M., Godfrey, D. G. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).
- Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice. Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).
- Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization. Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).
- Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages. Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).
- Vincendeau, P., Daëron, M. Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses. Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).
- Holzmuller, P., et al. Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics. Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).
- Holzmuller, P., et al. How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?. Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).
- Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi. Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).
- Herbert, W. J., Lumsden, W. H. Trypanosoma brucei: a rapid "matching" method for estimating the host’s parasitemia. Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).
- Dauchy, F. A., et al. Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).
- Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).
- Albright, J. W., Albright, J. F. In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol. International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).
- Gobert, A. P., et al. L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis. Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).
- De Muylder, G., et al. A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).
- Nzoumbou-Boko, R., et al. Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog. Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).
- Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated. PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).
- Albisetti, A., et al. Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei. PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).
- Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate. Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).
- Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).
- Mazet, M., et al. Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).
- Coutton, C., et al. Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human. Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).
- Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake. Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).
- Barrett, M. P., et al. Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes. Pathogens. 6 (4), (2017).
- Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes. Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).
- Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism. Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).
- Cruz-Saavedra, L., et al. Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies. Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).
- Lemesre, J. L., et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).
