Rensning af ekstracellulære Trypanosomes, herunder Afrika, fra blod af Anion-vekslere (Diethylaminoethyl-cellulose kolonner)
Summary
Denne metode til trypanosome adskillelse fra blod afhænger deres overflade afgift er mindre negative end pattedyr blodlegemer. Inficeret blod er placeret og behandles på en anionbytteren kolonne. Denne metode, den mest passende diagnostiske for afrikanske trypanosomiasis, giver renset parasitter for immunologiske, biologiske, biokemiske, farmaceutiske og molekylærbiologiske undersøgelser.
Abstract
Denne metode giver mulighed for adskillelse af trypanosomes, parasitter ansvarlig for dyrs og menneskers afrikanske trypanosomiasis (HAT), fra inficeret blod. Dette er den bedste metode til diagnosticering af første etape HAT og desuden denne parasit rensning metode tillader serologiske og forskning undersøgelser.
HAT er forårsaget af tsetsefluen overføres Trypanosoma brucei gambiense og T. b. rhodesiense. Relaterede trypanosomes er animalske trypanosomiasis agenser. Registrering af trypanosome er afgørende for HAT diagnose, behandling og opfølgning. Den teknik beskrevet her er den mest følsomme parasit opdagelse teknik, tilpasset feltforhold til diagnosticering af T. b. gambiense HAT og kan afsluttes inden for en time. Blod er lagdelt en anionbytteren kolonne (DEAE cellulose) tidligere justeres til pH 8, og eluering buffer er tilføjet. Meget negativt ladede blodlegemer er adsorberet på kolonnen, mens de mindre negativt ladede trypanosomes passere gennem. Indsamlede trypanosomes er pelleted ved centrifugering og observeret ved mikroskopi. Desuden tilberedes parasitter uden cellulære skader, samtidig med at deres smitteevne.
Renset trypanosomes er nødvendige for immunologisk test; de bruges i trypanolysis assay, guldstandarden i HAT serologi. Farvede parasitter er udnyttet i kortet-agglutinationstest (Karina) for feltet serologi. Antigener fra renset trypanosomes, såsom variant overflade glykoprotein, exoantigens, er også brugt i forskellige immunassays. Proceduren beskrevet her er designet til afrikanske trypanosomes; kromatografi betingelser skal derfor tilpasses til hver trypanosome stamme, og mere generelt til blodet af hver art af vært pattedyr.
Disse fascinerende patogener er let renset og tilgængelig til brug i biokemiske, molekylære og Cellens biologi undersøgelser herunder Co kultur med værtsceller at undersøge vært-parasit relationer på niveauet af membranreceptorer, signalering og gen udtryk; Drug test in vitro; undersøgelsen af genet sletning, mutation eller overekspression på metaboliske processer, cytoskeletal Biogenese og parasit overlevelse.
Introduction
Metoden fremlægges beskrevet her giver mulighed for adskillelse af trypanosomes, parasitter ansvarlig for dyrs og menneskers afrikanske trypanosomiasis (HAT), fra blodet. Dette er den bedste metode til diagnosticering af første etape HAT og desuden denne parasit rensning metode tillader robust serologiske og forskning undersøgelse.
HAT er forårsaget af tsetsefluen overføres Trypanosoma brucei gambiense og T. b. rhodesiense1. Disse protozo parasitter formere extracellularly i blodbanen, lymfeknuder og interstitielle væsker under den første fase af sygdommen (hemolymphatic fase). Den anden fase (meningoencephalitic fase) begynder når parasitter krydse blod-hjerne barrieren; neurologiske tegn, herunder en søvnforstyrrelse, der har givet sit navn “sovesyge” til denne sygdom, er typisk for denne anden fase2. Relaterede trypanosomes (T. evansi, T. congolense, T. vivax, T. b. brucei) er de agenser af animalsk afrikanske trypanosomosis (AAT)3.
Verdenssundhedsorganisationen (WHO) har til formål at eliminere HAT som et offentligt sundhedsproblem i 2020 og stoppe transmission af 20304. Den nylige indførelse af hurtige diagnose tests har forbedret serologiske diagnosticering1,4,5. Adskillige molekylære diagnostiske tests er blevet udviklet, men deres rolle i feltet diagnostik er endnu ikke blevet etableret5. De bruges til at identificere underarter af brucei gruppe og atypiske trypanosomiasis forårsaget af parasitter ansvarlig for animalske trypanosomosis6.
Påvisning af parasitten er afgørende for diagnose, behandling og opfølgning, som serum kan give falsk positive og desværre falske negative resultater1. Den direkte mikroskopiske observation af disse hemoflagellate protister er vanskeligt i HAT sager, der er forårsaget af T. b. gambiense, (mere end 95% af tilfældene), som lav parasitemias er reglen, for HAT som følge af T. b. rhodesiense, en stor antallet af parasitter er ofte til stede i blodet. Forskellige koncentration teknikker har været brugt som tyk drop og kapillarrør centrifugering (CTC), men adskillelse af parasitter blod af en kolonne af anionbytter (DEAE cellulose) efterfulgt af centrifugering og mikroskopiske observation af den pellet, er den mest følsomme metode (ca. 50 parasitter/mL blod kan detekteres)1,7. Rensning af trypanosomes af denne anion-vekslere (DEAE cellulose) metode er derfor bedst, og til dato er referencemetoden for visualisering og isolere parasitter fra blod til HAT diagnose. I marken, en mini kolonne af DEAE cellulose held har været anvendt og flere forbedringer har fremmet mikroskopiske observation7,8.
Metoden trypanosome adskillelse fra blod, beskrevet nedenfor, afhænger af parasitten overflade afgift, som er mindre negative end pattedyr blodlegemer9. Interessant, denne metode blev udviklet for 50 år siden, i 1968 af Dr. Sheila Lanham, og stadig er guld standard for påvisning og forberedelse af blodbanen trypanosomes. Det er hurtigt og reproducerbare for salivarian trypanosomes fra en bred vifte af pattedyr, tillader diagnosticering af både dyrs og menneskers trypanosomiasis10.
For at opnå levende, renset parasitter, er inficeret blod tilføjet en anionbytteren kolonne. Kromatografi betingelser (hovedsagelig pH-Ioniske styrken af buffere/media) skal tilpasses til hver trypanosome arter, og mere generelt, at hver blanding af pattedyr blodlegemer og trypanosomes10. Eluering buffer er netop indstillet til pH 8 for de fleste afrikanske trypanosomes10. Denne metode favoriserer koncentrationen af parasitter fundet i blodet hos patienter, fordi parasitemias kan være for lav til at blive opdaget af mikroskopiske observation alene, og det giver også mulighed for laboratorieundersøgelser. Arbejde med frisk isoleret trypanosomes og på blodet fra smittede dyr, ved hjælp af denne teknik, er mere relevant for forskellige undersøgelser end undersøgelser med parasitter, der har været kulturperler i axenic betingelser i laboratoriet på ubestemt tid.
Vært-parasit relationer er bedst studeret hos en parasit inficere sin naturlige vært, derfor, T. musculi, en naturlig murine parasit, som er repræsentant for ekstracellulære trypanosomes, har mange fordele som murine infektion omfatter i en lille laboratorium animalsk og gør ikke forlange biohazard niveau (BSL) sikkerhedsforhold. T. musculi dræbe ikke immunkompetente mus, i modsætning til mange andre Trypanosoma arter, herunder menneskelige patogener. T. musculi elimineres ikke i T-celle-berøvet mus og parasitemias kan øges i inficerede mus ved at ændre fødevarer og næringsstoffer indtagelse11. Denne parasit modulerer immunrespons i co-infektioner med andre patogener12. T. musculi fra inficerede mus udviser forskelle fra kulturperler T. musculi, for eksempel udtryk for Fc membranreceptorer er tabt i T. musculi axenic kulturer, i forhold til parasitter renset fra inficerede mus13 , 14. Excreted-udskilles faktorer (ESF) er også kvalitativt og kvantitativt mindre udtrykt i axenic trypanosome kulturer og varierer mellem isolerede i endemiske områder15stammer. ESF er de første antigener til at blive vist på vært immunsystemet og så spiller en vigtig rolle i den oprindelige vært immunrespons16.
I eksperimentelt inficerede dyr for laboratorieundersøgelser letter denne protokol eksperimenter på et større antal parasitter, minimere antallet af mus kræves især når du bruger immunosuppressed dyr. De variant overflade glykoproteiner (VSGs), der anvendes i kortet-agglutinationstest for Trypanosomiasis (Karina) i masse screening er stadig renset fra trypanosomes, som er opformeret i rotter. De to hurtige diagnostiske test (individuelt indpakkede kassetter), er nu tilgængelige til brug i feltet stadig bruger en smitsom model kilde til native VSGs og ikke i vitro kulturperler trypanosomes1,4, 5. avancement i undersøgelsen af trypanosome immunologi og biologi er blevet fremmet, da disse DEAE cellulose renset parasitter kan opnås nemt, i store mængder fra naturligt eller eksperimentelt inficerede værter, og i særdeleshed gnavere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Renset trypanosomes repræsenterer et stærkt middel til at studere immunologi, biokemi, cellulær og molekylær biologi. Store vidder af data og resultater er opnået ved trypanosomes, som derefter har bidraget til at indhente oplysninger fra andre eukaryote celler30. Trypanosomes er også genstand for vigtigt og interessant forskning, fordi de har udtænkt utallige mekanismer, der tillader dem at overleve og vokse i to meget forskellige miljøer: tsetsefluen vektor og pattedyr vært<sup class="x…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle medlemmer af UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Denne forskning blev støttet af indre finansiering fra universitetet i Bordeaux og støtte fra ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, og fra Association pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale og Service de Coopération et d’action culturelle de l’Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).
Materials
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
References
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review. Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).
- Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).
- Büscher, P., Deborggraeve, S. How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).
- Truc, P., et al. Atypical human infections by animal trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).
- Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).
- Büscher, P., et al. Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).
- Lanham, S. M. Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).
- Lanham, S. M., Godfrey, D. G. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).
- Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice. Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).
- Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization. Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).
- Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages. Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).
- Vincendeau, P., Daëron, M. Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses. Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).
- Holzmuller, P., et al. Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics. Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).
- Holzmuller, P., et al. How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?. Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).
- Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi. Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).
- Herbert, W. J., Lumsden, W. H. Trypanosoma brucei: a rapid "matching" method for estimating the host’s parasitemia. Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).
- Dauchy, F. A., et al. Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).
- Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).
- Albright, J. W., Albright, J. F. In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol. International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).
- Gobert, A. P., et al. L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis. Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).
- De Muylder, G., et al. A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).
- Nzoumbou-Boko, R., et al. Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog. Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).
- Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated. PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).
- Albisetti, A., et al. Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei. PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).
- Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate. Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).
- Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).
- Mazet, M., et al. Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).
- Coutton, C., et al. Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human. Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).
- Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake. Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).
- Barrett, M. P., et al. Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes. Pathogens. 6 (4), (2017).
- Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes. Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).
- Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism. Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).
- Cruz-Saavedra, L., et al. Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies. Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).
- Lemesre, J. L., et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).
