Induserbart og reversibel dominerende-negativ (DN) Protein hemming
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å utvikle en dominerende-negativ induserbart system, der alle protein kan betinget deaktiveres av reversibel overexpressing en dominerende-negativ mutert versjon av den.
Abstract
Dominerende-negativ (DN) protein hemming er en kraftig metode å manipulere protein funksjon og tilbyr flere fordeler over andre genomet tilnærminger. For eksempel, selv om chimeric og Grobunn-LoxP målretting strategier mye brukt, iboende begrensninger av disse strategiene (dvs. lekk promoter aktivitet, mosaikk grobunn uttrykk, etc.) har betydelig begrenset deres program. Videre er en fullstendig sletting av mange endogene gener embryonically dødelig, gjør det umulig å studere gen funksjon i postnatal liv. For å møte disse utfordringene vi har gjort betydelige endringer i en tidlig genteknologi protokoll og kombinert kort (transgene) versjon av Rb1 genet med en lysosomale protease procathepsin B (CB), til å generere en DN musemodell av Rb1 (CBRb). På grunn av tilstedeværelsen av en lysosomale protease rutes hele CB-RB1 fusion protein og dens samspill kompleks til proteasome-mediert fornedrelse. Videre kan tilstedeværelsen av et tetracycline induser (rtTA) element i transgene Konstruer en induserbart og reversibel regulering av RB1 protein. Tilstedeværelsen av en allestedsnærværende ROSA-CAG promoter i CBRb musemodell gjør det en nyttig verktøyet å utføre forbigående og reversibel Rb1 gene ablasjon og gi forskerne en ressurs for å forstå sin virksomhet i nesten en celle type hvor RB1 er uttrykt.
Introduction
De fleste tilnærminger sikte på gene og protein ablations stole på permanent prosesser, som vanligvis fører til fullstendig eliminering eller trunkering av genet, RNA sekvenser eller protein av interesse (POI). Det overordnede målet med denne metoden er å en rekombinant protein for å avskaffe funksjonen endogene, vill-type protein. Vi har revisited og fornyet en alternativ strategi1,2, som gir den midlertidige ablation en POI gjennom DN hemming. Denne metoden fungerer for både multimeric og monomerisk peptider men er best egnet for proteiner som fungerer i en multimeric samling.
Metoden består av blander den lysosomale protease CB til en undergruppe til en multimeric POI (CB fusion komplekse). Den resulterende CB fusion komplekse kan samhandle med og proteolytically fordøye endogene protein eller viderekoble hele CB-POI komplisert å lysosome være dårligere3. Dessuten, en kombinasjon av CB fusion kompleks med induserbart natur tetracycline-kontrollerte transcriptional Aktivisering (Tejo) systemet gir uttrykk induserbart og kontrollert av transgene i en reversibel mote2. Selv om det er nyttig i mange tilfeller, kan fullstendig sletting av gener eller proteiner i vivo føre dødelighet4,5,6. Likeledes, vev-spesifikke, betinget sletting av noen gener eller proteiner ved hjelp av grobunn/Lox systemet kan ikke være enkelt, som det vil til slutt føre til permanent tap av kritisk genomisk elements7. Derfor, avhengig av genet eller POI, ingen av disse metodene vil være effektiv inne skaffer nyttig modell for etterfølgende studier, spesielt gener eller proteiner funksjonelle studier i slutten postnatal og voksen mus.
For å omgå problemene knyttet til slike tilnærminger og gi bevis-av-prinsippet om effektiviteten av foreslåtte metoden, har vi valgt å teste metoden presentert her ved å generere en betinget DN versjon av Retinoblastoma 1 (RB1) protein. Flere alternativer er foreslåtte8,9,10 å avskaffe funksjonen av endogene RB1; men alle av dem møtte noen av de samme begrensningene som er beskrevet ovenfor: permanent germline sletting av RB1 er embryonically dødelig, og samsvar med sin tumor suppressor rolle, permanente RB1 betinget sletting fører til en rekke svulster11. Selv om en DN versjon av RB1 ikke synes å oppstå naturlig, et bedre alternativ tilgjengelig strategier bør tillate en timelig kontrollert inaktivering av endogene RB1 og tilbyr en alternativ mekanisme til slutt gjenopprette sine funksjonen. Grunnlaget for slik en konstruksjon ble beskrevet over to tiår siden1. Men på grunn av teknologiske begrensninger manglet det en mekanisme for å kontrollere transgene aktivering, svar og vev spesifisitet. Denne studien er først til å kombinere eleganse doxycycline (Dox)-avhengige transcriptional system med en konstruert transgene konstruere lysosomale protease CB og Rb1 proteiner. Den resulterende CBRb mus modellen gir en midlertidig regulert Dox-mediert RB1 forskrift2. Fordelen av benytter slik proteom-basert tilnærming til å studere gen funksjon er at det kan bli vedtatt for noen genet av interesse, med minimal informasjon om sin virksomhet.
Den foreslåtte DN transgene strategien gir mange fordeler over tradisjonelle tilnærminger. Først fører DN protein hemming til bare en delvis ablasjon i protein aktivitet, dermed bevare en gjenværende endogene uttrykk. Slikt resultat er svært ønskelig i situasjoner der en fullstendig eliminering av protein aktivitet fører til embryonale dødelighet, sterkt begrense en undersøkelse for å studere gen funksjon i levende mus. Andre kan tilstedeværelsen av Tejo systemet transgene aktivisering kun gjennom en antibiotika, noe som gir en effektiv og reversibel kontroll av transgene aktivitet. Dermed transgene systemet kan deaktiveres ved opphør av antibiotikumet administrasjon, og et vanlig RB1 uttrykk er tilbake på plass. Tredje kan spesifisiteten av transgene uttrykket variere avhengig av arrangøren av valg. Mens vi har valgt allestedsnærværende ROSA-CAG arrangøren for bevis-av-prinsippet, er plassere transgene under en vev-spesifikke promoter sannsynlig å begrense uønsket transgene uttrykk og lette studier på terapeutiske anvendelse av denne transgene metodikk.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å omgå begrensningene knyttet til tradisjonelle transgene strategier, forsøkte vi å generere en musemodell der en endogen POI kan betinget deaktiveres av overexpressing en DN mutant form for det på en spatiotemporal måte. For å avskaffe funksjonen av endogene severdigheter, er flere alternativer foreslått15,16,17. Vi har endret en tidligere genetisk strategi1 ved å kombinere Dox-avhengige tra…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCS2 + CB-Myc6 vektor var en gave fra Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, USA). HEI-OC1 cellene fotograferingen av Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Kundestøtte ble levert av UNMC musen genomet Engineering kjernen (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) og Creighton University integrert biomedisinsk bildebehandling anlegget (Richard Hallworth, John Billheimer). I UNMC musen genomet Engineering ble støttet av en institusjonell utvikling pris (idé) fra NIH/NIGMS, gi nummer P20 GM103471. Integrert biomedisinsk bildebehandling anlegget ble støttet av Creighton University School of Medicine og gir GM103427 og GM110768 fra NIH/NIGMS. Anlegget ble bygget med støtte fra tilskudd fra National Center for forskning ressurser (RR016469) og NIGMS (GM103427). Musen linjene generert i denne studien ble opprettholdt på Creighton Universitys dyr ressurs anlegget, som infrastruktur ble forbedret gjennom et stipend ved NIH/NCRR G20RR024001. Dette arbeidet fikk forbi støtte gjennom en NIH/NCRR 5P20RR018788 – NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE gi (til Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) og en nye forskningsstipend fra Hearing Health Foundation (til S. Tarang). Innholdet i denne forskningen er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Biologie du développement. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Génétique. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
