טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) אתרים הדמיה המעורבים בניסויים מחקר קליני מוקדם מרובים צריך יכולות הייצור radiotracer חזקים ופסיביות. שימוש radiotracer את [18נ] Clofarabine כדוגמה, אנחנו להמחיש כיצד להפוך לאוטומטית את הסינתזה של radiotracer באמצעות radiosynthesizer גמיש, מבוססי קלטת ולאמת את הסינתזה לשימוש קליני.
התפתחות חדשה טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) המשדרים הוא הפעלת חוקרים ומטפלים לשיקוף מערך רחב יותר ויותר של מטרות ביולוגיות ותהליכים. עם זאת, הגדלת מספר קליעים נותבים שונים יוצר אתגרים עבור הייצור שלהם ב- radiopharmacies. בעוד היסטורית עברו מעשי להקדיש תצורה מותאמת אישית radiosynthesizer ותא חם לייצור חוזרות ונשנות של כל מעקב בודדים, זה הופך כדי לשנות זרימת עבודה זו. לאחרונה radiosynthesizers מסחרי המבוסס על קלטות/ערכות חד פעמיות עבור כל מעקב לפשט את הייצור של המשדרים מרובים עם סט אחד של ציוד על-ידי ביטול הצורך שינויים ספציפיים מעקב מותאמת אישית. יתר על כן, חלק radiosynthesizers אלה מאפשרות למפעיל לפתח, לייעל משלהם פרוטוקולים סינתזה בנוסף רכישת ערכות זמין מסחרית. ב פרוטוקול זה, אנו לתאר את נוהל כללי איך יכול להיות אוטומטי הסינתזה ידנית של מכשיר מעקב חיית מחמד חדשה על אחד radiosynthesizers האלה ואומת עבור הייצור של המשדרים קליני-כיתה. לדוגמה, אנו משתמשים את radiosynthesizer ELIXYS, כלי גמיש radiochemistry מבוססי קלטת יכול לתמוך מאמצי פיתוח חיצי מעקב עבור חיית המחמד, כמו גם ייצור שגרתית בדיקה קלינית באותה מערכת, כדי לייצר [18נ] Clofarabine ([ 18 F] פרנק), מכשיר מעקב חיית המחמד למדוד ויוו פעילות אנזים deoxycytidine קינאז (dCK). בתרגום סינתזה ידנית כוללת פירוק פרוטוקול סינתטי לתוך תהליכים בסיסיים radiochemistry מכן תורגמו ל כימיה אינטואיטיבי “יחידת פעולות” נתמך על ידי סינתיסייזר התוכנה. פעולות אלה ואז במהירות ניתן להמיר תוכנית סינתזה אוטומטית על ידי הרכבת אותם באמצעות ממשק גרור-ושחרר. לאחר בדיקות בסיסיות, ההליך סינתזה וטיהור עשויים לדרוש אופטימיזציה כדי להשיג את התשואה הרצוי ואת טוהר. לאחר ההופעה הרצויה מושגת, אימות של הסינתזה מתבצעת כדי לקבוע התאמתו לייצור radiotracer לשימוש קליני.
מגוון הולך וגדל של מטרות הביולוגי ניתן לאבחן באופן דינמי חי הנבחנים באמצעות הדמיה מולקולרית את המודאליות פט חיית המחמד מספק ויוו מבחני של תהליכים ביולוגיים, ביוכימיים, תרופתי ספציפי על-ידי שימוש ספציפי radiotracers (מולקולות המסומנת radionuclides פולטי פוזיטרונים) זה מוזרקים לתוך הנושא לפני הדמיה1. שימוש מוגבר של חיית המחמד ללמוד מגוון רחב של תהליכים אלה מדע בסיסי ומחקר קליני-2,–3,–4, וכן את הגילוי, פיתוח ושימוש קליניים של תרופות בחולה5, 6, מוביל את הביקוש להופעות radiotracers מגוונים7,8. כדי למנוע חשיפה לקרינה כדי radiochemist ולהבטיח הפקה לשחזור של אלה המשדרים קצרת ימים, הם בדרך כלל מיוצרים באמצעות radiosynthesizer אוטומטית של הפועלים בתוך “תא חם”. Radiosynthesizers האחרונות השתמש ארכיטקטורת חד פעמיים-קלטת/ערכת כדי לפשט את המשימה של ציות קליני-כיתה הייצור ומספקת את הגמישות להכין מספר סוגים של radiotracers פשוט על ידי בהחלפת קלטות9 . עם זאת, בשלבים הקלינית המוקדמות, יש בדרך כלל אין ערכות/קלטות זמין מסחרית כדי לבצע את radiosynthesis אוטומטי; כתוצאה מכך, מתקני ייצור תרופות לחיות מחמד נאבקים להתאים אישית את המערכות ליישם יכולות מעקב cGMP-כיתה של ייצור בתוך פרק זמן מתאים, במחיר סביר. לפיכך, radiosynthesizers פותחו המשלבות את הארכיטקטורה קלטת/ערכת תכונות כדי להקל על פיתוח, אופטימיזציה של המשדרים.
פלקס/כימית ELIXYS (ELIXYS) הוא דוגמה radiosynthesizer מבוססי קלטת גמיש עם רחב ריאגנט הממס, התגובה הטמפרטורה תאימות10. יש שלושה כלי התגובה והוא משתמש מנגנון רובוטית כדי להגדיר באופן דינאמי את המעבר נוזלים כנדרש על-ידי כל פרוטוקול של סינתזה מסוים11. סינתיסייזר התוכנה מאפשר היצירה של תוכניות סינתזה (רצף) עבור המשדרים שונה על-ידי גרירה ושחרור יחידת פעולות כגון השמנה איזוטופ, Elute איזוטופ, הוספת ריאגנט, להגיב, מתאדים12. כל פעולה יחידה יש מגוון של פרמטרים הניתנים לתכנות לרשות המפעיל, כגון משך, טמפרטורהאו גז אינרטי נהיגה לחץ (לחץ). על ידי הבנת הטבע של כל פעולה יחידה, סינתזה ידני יכול להיות מתורגם בקלות לתוך רצף של פעולות יחידה, ואז ניתן לשנות במהלך אופטימיזציה של פרוטוקול13. בשילוב עם מודול ELIXYS טהור/טופס, מערכת משולבת, באפשרותך לבצע על ניסוח של מעקב חיית המחמד וטיהור אוטומטית. משתמש זה radiosynthesizer, אנחנו דיווחו בעבר כי הסינתזה אוטומטיות של המשדרים התווית על-ידי F שונים 1824 ו קבוצות prosthetic11,14,15,16, כמו גם radiofluorination אנזימטי אוטומטיות של מולקולות17, פשוט על ידי שינוי ריאגנטים, לא את התצורה של המערכת. אחרים הראו הסינתזה אוטומטיות של [18נ] RO6958948 עבור ההדמיה של טאו neurofibrillary קשרים18, סינתזה אוטומטיות של הקבוצה prosthetic [18F] F-Py-TFP עם תיוג עוקבות של פפטידים19 , סינתזה אוטומטיות של [18נ] AM580 עבור ההדמיה של phosphodiesterase 10a (PDE10A)20. יתר על כן, מספר קבוצות הראו את הייצור של המשדרים מתאים לשימוש קליני, כולל 4-[18נ] Fluorobenzyl-triphenylphosphonium ([18נ] FBnTP) עבור ההדמיה של קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאליים21, [ 18 DCFPyL F] עבור ההדמיה של הערמונית ספציפיים ממברנה אנטיגן (PSMA)22, ו [18F] תודה-5351 עבור ההדמיה של טאו23.
בנייר זה, אנו משתמשים הניסיון שלנו עם [18F] פרנק כדי להמחיש כיצד הליך radiosynthetic ידנית שניתן יהיה אבר המין הגברי, במהירות לתרגם סינתזה האוטומטי מתאים לייצור שוטף בעקבות הנחיות cGMP. רכיב המעקב [18F] פרנק תוכנן עבור ההדמיה של פעילות dCK. Radiosynthesis ידני של [18F] פרנק תוארה לראשונה על ידי שו. et al. 24 כמו הליך באמצעות שתי ספינות התגובה, סיליקה ביניים מחסנית לטיהור טיהור HPLC הסופי של צעד (ראה חומר משלים, בסעיף 1 לפרטים). האחרונות במבחנה פרה מחקרים הראו יחודיות יוצאת דופן של זה מעקב כדי dCK, הראשון בהאנושית מחקרים הראו biodistribution רייטינג25. יש עניין מיידי במחקרים קליניים בקנה מידה רחב יותר, כדי לאשר את הרגישות של [18F] פרנק חיית המחמד וריאציות בפעילות dCK, עניין וקהילותיהם יישומים קליניים אפשריים של זה מעקב26. זה עשוי להיות סמן שימושי עבור טיפולים להפעיל הפעלה T-cell, לגרום נזק לדנ א או להסתמך על prodrugs אנלוגיים תלויי-dCK nucleoside. בפרט, [18F] פרנק עשוי לאפשר השיכוב של חולים לתגובה פוטנציאליים על הטיפול עם Clofarabine. [18נ] פרנק עשויה להקל גם את המחקר והפיתוח של מעכבי dCK זה מתקדמים לכיוון בניסויים קליניים. מאז זה מעקב יש באופן מסורתי היו מסונתז באופן ידני, לקדם את כל המחקרים הללו דורש סינתזה אמין, אוטומטיות של [18F] פרנק מתאים לשימוש קליני.
למרות דיווחנו בעבר סינתזה אוטומטיות של [18F] פרנק עבור מחקרים פרה16, פרוטוקול זה בונה בהמשך המאמצים הללו ומתאר שינויים נוספים הדרושים לייצור קליני של מעקב זה, כולל השילוב של טיהור-ממוחשב במלואו, ניסוח פרוטוקול אימות, בדיקות בקרת איכות. כללי בהליכים המתוארים כאן אינם מוגבלים פיתוח של סינתזה אוטומטית ומתאים קלינית [18F] פרנק אבל אפשר להכליל באופן ישיר לפתח אוטומטית syntheses מתאים לשימוש קליני של השני radiotracers עם פלואור-18 תוויות.
פרוטוקול זה מגדיר את השלבים הבסיסיים שיש לנקוט בעת הפיכת פרוטוקול סינתזה ידנית כדי להשיג את הייצור של ניסוח מעקב קליני כיתה. כל מחזור הפיתוח, לרבות בקרת איכות פיתוח, ומעוררות את radiotracer [18F] פרנק (עבור ההדמיה של פעילות dCK). תשומת לב מיוחדת הוקדשה שינוי הסינתזה אוטומטית כדי להבטיח ההתאמה של המעקב לשימוש קליני. הסינתזה כרוך תהליכים בסיסיים כגון את ההפעלה של פלואוריד [18F], radiofluorination של מולקולה קודמן, טיהור מחסנית ביניים, הסרת הגנה-הקבוצה, ו למחצה מפוח HPLC טיהור ניסוח להזרקה. תהליכים בסיסיים אלה מהווים רפרטואר סטנדרטי המספיק לסינתזה של הרוב המכריע של 18מחמד התווית על-ידי F המשדרים.
בזמן עיצוב הסינתזה, הבחירה של ריאגנטים ואבטחת האיכות שלהם יש חשיבות מיוחדת לשימוש קליני. להבטיח את התכנות הנכון והקשרים נכונה על-ידי ביצוע סינתזה מעושה (ממיסים בלבד) הכרחי כדי למנוע שגיאות בלתי צפויות כאשר הסינתזה מבוצע עם רדיואקטיביות. אופטימיזציות סינתזה עוקבות (ממיסים, אמצעי אחסון, כמויות, טמפרטורות, זמני התגובה והתנאים טיהור) תלויים מעקב חיית המחמד ספציפי בהתפתחות. במהלך ניסויים אלה, מיקוד מסוים צריך להיות זרחו על טוהר כימי, רדיוכימי של המוצר הסופי ניתן להשיג, כמו אלה חייב לעמוד בדרישות מחמירים לשימוש קליני. סינתזה שמייצר מוצר טהור של פעילות נמוכה יותר אבל מספיק התשואות בצורה אמינה היא עדיפה בדרך כלל על תהליך גבוהות תנובה, כי יש סיכון להיכשל בצורה אקראית. לאחר הסינתזה מוטבה במידה מספקת, התהליך הסופי צריך לעבור בדיקות אימות (דרישה רגולטורית) כדי להבטיח התאמה קלינית. שיטת סינתזה המאומת ואז ניתן לייצר את חיית המחמד מעקב לשימוש קליני. כאשר סינתזה מכשיר מעקב חיית המחמד על פי שיטה מאומתים, נהלי שיש ביסודיות אחריו. כדי להבטיח תאימות, התוכנה מתוכנת המפעיל לוודא השלמת השלבים החשובים באמצעות רשימה ריצה מראש לאחר לחיצה על הפעל כדי להתחיל את הסינתזה. בעוד המערכת תבצע את הסינתזה בצורה אוטומטית, הצעד טיהור דורש התערבות ידנית. המפעיל חייב לכן, מתצפתים על המסך כרומטוגרפי במהלך השלב טיהור HPLC, קלט ידני בזמן אמת כאשר כדי להתחיל ולהפסיק איסוף השבר המוצר.
במסגרת מאמצינו אוטומציה ואופטימיזציה לסינתזה פרנק [18F], לנו יש יעיל בשיטת טיהור HPLC מפוח למחצה של תערובת המוצר באמצעות מערכת הממס להזרקה המורכב אמוניום אצטט פתרון ו EtOH ; השיטה הקודמת שלנו נדרש צעד נוסף להחלפת הממס לאחר טיהור16. ניסוח עוקבות לעבד, לכן, צריך רק להפחית את התוכן EtOH של השבר שנאספו כדי מותר רמות, וכדי להבטיח את isotonicity שלה, אשר שניהם יכול להתבצע על ידי דילול. הצעד ניסוח בוצעה באמצעות תוכנית שנייה המורכב פעולת יחידת ניסוח יחיד כדי לאפשר תוספות אמצעי האחסון משתנה של NaCl-פתרונות לספר המוצר מטוהרים שבר באמצעות מודול ניסוח עבור המשתנה נפח שהושג לאחר טיהור HPLC. אם נפח המוצר שנאספו השבר היה מוגדר להיות קבוע במקום, הפעולה היחידה ניסוח יכול להיכלל בתוכנית סינתזה הראשי, נמנע הצורך תוכנית עצמאית. גישה חלופית כדי למנוע התערבות ידנית יהיה להשתמש את הפונקציונליות המלאה של המודול ניסוח (למשללדלל את רכיב המעקב מטוהרים עם מים השמנה על מיכל דיו מוצק-שלב מיצוי סי18, לשטוף אותו, elute אותו עם נפח קבוע של EtOH ואני בסופו של דבר, לדלל את זה עם נפח קבוע של תמיסת מלח).
הטכניקה המובאת כאן עבור אימות פרוטוקול סינתזה לשימוש קליני והפיכתה נועד להיות די כללי. דרך הבחירה של radiosynthesizer (ELIXYS), מגוון רחב של syntheses יכול להיות אוטומטי ואומתו. זה כולל מורכבות 3 סיר syntheses, או syntheses מעורבים טמפרטורות גבוהות של ממיסים נדיפים. אופטימיזציה של סינתזה יכולה להיות מושגת על ידי שינוי הפרמטרים של התוכנה. סינתיסייזר תכונות כדי לנטר את ההשפעה של שינויים, כגון מיקום כלי תגובה עבור הסרת דגימות לניתוח TLC-רדיו או רדיו-HPLC. עם זאת, בלי שינויים במערכת, המערכת כיום אינו מאפשר לטיפול של אמצעי אחסון ריאגנט נמוך מאוד (~ 5-20 µL), מוצר ביניים זיקוק או הטיפול [18F] אלף, 68Ga, או radiometals אחרים. אם הסינתזה ידנית כדי להיות אוטומטי מכיל שלבים כאלה הם מצויין, אוטומציה ובדיקת בפלטפורמת radiosynthesizer עוד עשוי להיות מתאים.
למרות עבודה זו התמקדה הפיתוח של פרוטוקול לייצור אוטומטית [18F] פרנק לשימוש קליני, הסינתזה של רבים אחרים המשדרים מחמד יכול להיות אוטומטי באופן מתאים לייצור קליני, בעקבות אותו היגיון, שיטות. בעקבות השיטה המוצגת כאן, אנחנו הסתגלו. גם הסינתזה אוטומטיות של 9-(4-[18F] פטור – 3-[hydroxymethyl] בוטיל) גואנין ([18נ] FHBG) ואומת זה לשימוש קליני. פרוטוקולים הוקמה המשתמש ניתן להעלות שהורדו מהרשת סופי בדיקה, פורטל אינטרנט לשיתוף סינתזה תוכניות, הקשורים תיעוד בין אתרים שונים radiopharmacy27. זה יכול למנוע העתקה של מאמצים בקהילה, להקל על מחקרים קליניים רב מרכזי מעורבים דימות PET.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכו באופן חלקי על ידי המכון הלאומי לסרטן (R44 CA216539) וקרן UCLA של תרומה שנעשו על ידי ראלף, מרג’ורי קראמפ עבור המכון Crump UCLA הדמיה מולקולרית.
ELIXYS FLEX/CHEM | Sofie (Culver City, CA, USA) | 1010001 | Radiosynthesizer |
Radiosynthesizer cassette | Sofie (Culver City, CA, USA) | 1861030400 | Cassette for ELIXYS FLEX/CHEM |
ELIXYS PURE/FORM | Sofie (Culver City, CA, USA) | 1510001 | Radiosynthesizer purification module |
[O-18]H2O | IBA RadioPharma Solutions (Reston, VA, USA) | IBA.SP.065 | >90% isotopic purity |
[F-18]fluoride in [O-18]H2O | UCLA | N/A | Produced in a cyclotron (RDS-112; Siemens; Knoxville, TN, USA) by the (p,n) reaction of [O-18]H2O. Bombardment at 11 MeV using a 1 mL tantalum target with havar foil. |
Deionized water | UCLA | N/A | Purified to 18 MΩ and passed through 0.1 µm filter |
Acetonitrile (MeCN) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 271004 | Anhydrous, 99.8% |
Ethanol (EtOH) | Decon Laboratories, Inc. (King of Prussia, PA, USA) | 2701 | Anhydrous, 200 proof |
Sodium hydroxide (NaOH) solution | Merck (Burlington, MA, USA) | 1.09137.1000 | 1M solution |
Hydrochloric acid (HCl) solution | Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) | SA48-500 | 1M solution |
Ethyl acetate (EtAc) | Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) | E195SK-4 | HPLC grade |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) | S-640-500 | USP grade |
Ammonium acetate | Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) | A639-500 | HPLC grade |
Potassium carbonate (K2CO3) | Fisher Chemical (Hampton, NH, USA) | P-208-500 | Certified ACS |
CFA precursor | CalChem Synthesis (San Diego, CA, USA) | N/A | Custom synthesis |
Cryptand 222 (K222; Kryptofix 2.2.2) | ABX Advanced Biochemical Compounds (Radeberg, Germany) | 800.1000 | >99% |
Sodium chloride (NaCl) solution (saline) | Hospira (Lake Forest, IL, USA) | 0409-4888-02 | 0.9%, for injection, USP grade |
Silica cartridge | Waters (Milford, MA, USA) | WAT051900 | Sep-pak Classic |
Quaternary methylammonium (QMA) cartridge | Waters (Milford, MA, USA) | WAT023525 | Sep-pak Light Plus |
Sterile syringe filter (0.22 µm) | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | SLGSV255F | Millex-GV |
Glass V-vial (5 mL) | Wheaton (Millville, NJ) | W986259NG | Used for reaction vessels |
Septa | Wheaton (Millville, NJ) | 224100-072 | Used for reagent vials |
Crimp cap | Wheaton (Millville, NJ) | 224177-01 | Used for reagent vials |
Amber serum vial (2 mL) | Voigt (Lawrence, KS, USA) | 62413P-2 | Used for reagent vials |
Magnetic stir bar | Fisher Scientific (Hampton, NH, USA) | 14-513-65 | Used for reaction vessels |