CD4 का अलगाव+ टी कोशिकाओं और परिचालित टी के विश्लेषण-तोंसिल्लितिस सहायक (cTfh) परिधीय रक्त से सेल सबसेट का उपयोग कर 6-रंग प्रवाह Cytometry
Summary
यहां, मानव परिधीय रक्त से CD4+ टी सेल सबसेट के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । शुद्ध CD4+ टी कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण कर रहे है टी के अनुपात-तोंसिल्लितिस सहायक सेल सबसेट निर्धारित करते हैं ।
Abstract
ंयायपालिका टी-तोंसिल्लितिस सहायक (Tfh) सेल गतिविधि स्व-प्रतिरक्षित परिस्थितियों में detectable है और उनकी उपस्थिति नैदानिक परिणामों के साथ जुड़ा हुआ है जब लिम्फ नोड बी में microenvironment-सेल गैर Hodgkin लिंफोमा का विश्लेषण किया है । परिचालित टी-फुफ्फुसीय सहायक कोशिकाओं (cTfh), रक्त में Tfh कोशिकाओं के परिसंचारी स्मृति डिब्बे के उपसमुच्चय, भी रोग में परेशान और इसलिए संभावित उपंयास पूर्वानुमानात्मक मार्क्स का प्रतिनिधित्व करते हैं । परिधीय रक्त आधारित परीक्षण लाभप्रद है क्योंकि यह अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव है और सरल धारावाहिक की निगरानी की अनुमति देता है । यह आलेख मानव रक्त से CD4+ T-कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है, और cTfh कोशिकाओं और उनके विभिन्न उपसमुच्चय के अनुपात की गणना करने के लिए प्रवाह-cytometry द्वारा आगे विश्लेषण (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1, 2, 17 और cTfh1/17). इन उपसमुच्चय के स्तर पर तो सामांय विषयों और लिंफोमा के साथ रोगियों के बीच की तुलना में था । हमने पाया है कि विधि काफी मजबूत करने के लिए नियमित रूप से एकत्र रोगी सामग्री से विश्वसनीय परिणाम प्राप्त किया गया । तकनीक हम विश्लेषण के लिए वर्णन आसानी से सेल छंटाई और बहाव के रूप में आवेदन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है आरटी-पीसीआर ।
Introduction
t-तोंसिल्लितिस सहायक कोशिकाओं (Tfh) एक CD4+ टी-सेल सबसेट है कि शुरू में लसीकावत् ऊतकों में विशेषता थी1। इन कोशिकाओं पीडी-1 और CXCR5 सतह रिसेप्टर्स, स्रावित आईएल-21 और आईएल-4 और लेखन फैक्टर, BCL-62,3की परमाणु अभिव्यक्ति दिखाने एक्सप्रेस । जैसा कि उनके नाम से पता चलता है, वे कीटाणु केंद्रों में पाए जाते है और उच्च समानता एंटीबॉडी उत्पादन1के लिए आवश्यक हैं ।
Dysregulated Tfh प्रतिक्रियाओं रोग रोगजनन में फंसाया गया है, सबसे विशेष रूप से स्व-प्रतिरक्षित रोग, जहां वे के विस्तार को बढ़ावा देने के लिए प्रतिक्रिया बी कोशिकाओं4. ये दोनों सॉलिड5,6 और लसीकावत् कैंसर7के ट्यूमर microenvironment में भी भूमिका निभाते हैं । इसके विपरीत, inducible टी सेल costimulator (ICOS) मानव इम्यूनो सिंड्रोम8में परिणाम के रूप में Tfh समारोह के लिए आवश्यक सतह प्रोटीन के आनुवंशिक दोषों । CD4+ CXCR5+ मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं में परिचालित टी-फुफ्फुसीय सहायक कोशिकाओं (cTfh) है और माना जाता है Tfh कोशिकाओं के ऊतकों में स्मृति डिब्बे9। यहां वर्णित विधि का उद्देश्य परिधीय रक्त के नमूनों से CD4+ कोशिका अलगाव के बाद cTfh उपसमुच्चय का विश्लेषण है ।
कई cTfh सबसेट को परिभाषित किया गया है और वे B-कक्ष मदद प्रदान करने वाली दक्षता के लिए एक उपसमुच्चय से भिंन है9,10,11,12। इन उपसमुच्चय के सापेक्ष अनुपात रोगों की एक संख्या में बदल रहे हैं, सबसे प्रमुखता से स्व-प्रतिरक्षित रोग है जिसमें लगभग हमेशा अधिक कार्यात्मक पीडी में एक सापेक्ष वृद्धि है-1+/hi और/या cTfh2 या कम करने के लिए तुलना में cTfh17 सबसेट कार्यात्मक पीडी-1– और/cTfh1 उपसमुच्चय12. इन परिवर्तनों की हद तक अक्सर रोग गतिविधि और autoantibody titers सहित नैदानिक मापदंडों के साथ संबद्ध है, रोग में एक शकुन के रूप में cTfh सबसेट वितरण की एक संभावित भूमिका का संकेत है, जो में Tfh की गतिविधि को प्रतिबिंबित कर सकते है लसीकावत् ऊतकों9,12,13,14. इसके अतिरिक्त, प्रतिभागियों से रक्त के नमूने लेने, त्वरित सुरक्षित और स्वीकार्य है, और इसलिए रोग की प्रगति या चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया के विश्लेषण के लिए धारावाहिक की निगरानी की अनुमति देता है ।
पारंपरिक परिधीय रक्त mononuclear कोशिका (PBMNC) सस्पेंशनों पर पृथक CD4+ T-कोशिकाओं का उपयोग विश्लेषण के लिए पर्याप्त संख्या में cTfh कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय को कम करके उच्च प्रवाह प्रवाह cytometry प्रयोगों को सक्षम बनाता है । यह विशेष रूप से उपयोगी है जब दुर्लभ cTfh उपसमुच्चय से कोशिकाओं छंटाई प्रवाह सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS) का उपयोग कर । दक्षता को सहायता करने के लिए, इन सस्पेंशन को cryopreserved के प्रवाह cytometry प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले नमूनों की “बैचिंग” को सक्षम करने के लिए किया जा सकता है । परीक्षण करने पर CD4+ पवित्रता को cryopreservation से कम नहीं किया गया ।
जबकि विभिंन प्रयोगशालाओं उनकी खोज के प्रारंभिक दौर में cTfh कोशिकाओं वर्गीकृत करने के लिए अलग मार्करों का इस्तेमाल किया, विधि यहां प्रस्तुत सेल के दो समूहों के एक एकीकृत योजना का उपयोग करता है-सतह मार्करों के रूप में श्मिट एट अल.12द्वारा प्रस्तावित, 15 एक एकल प्रवाह cytometry प्रयोग में cTfh और उनके नौ मांयता प्राप्त सबसेट के एक साथ पहचान सक्षम करने के लिए ।
केवल सेल सतह मार्करों का उपयोग किया जाता है के रूप में, कोशिकाओं निर्धारण या permeabilization की आवश्यकता नहीं है, और इस प्रकार बहाव कार्यात्मक अध्ययन के लिए जीवित रह सकते हैं । यह सेल छंटाई एक ही एंटीबॉडी पैनल के साथ FACS का उपयोग करके सुविधा हो सकती है । इस पैनल को अंय मार्करों शामिल विस्तार किया जा सकता है, प्रवाह cytometer के प्रतिबंधों के लिए अनुमति इस्तेमाल किया जा रहा है ।
बहु रंग प्रवाह cytometry प्रयोगों के विश्लेषण 2 आयामी डॉट भूखंड पर गेटिंग के स्वाभाविक व्यक्तिपरक प्रकृति के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है, खासकर जब कोशिका आबादी मार्कर प्रतिदीप्ति में एक स्पष्ट द्वि-मोडल वितरण नहीं है, के रूप में है cTfh कोशिकाओं और उनके सबसेट के लिए मामला । इस कारण से, यह आवश्यक है कि कलाकृतियों को कम करने के लिए प्रभावी नियंत्रण स्थापित करने के लिए आबादी का बेहतर समाधान सक्षम और गेटिंग रणनीतियों आत्मविश्वास से स्थापित करें । जैसे, एंटीबॉडी पैनल डिजाइन और एक प्रवाह cytometry प्रयोग के लिए बुनियादी नियंत्रण के सेट अप, यानी, मुआवजा और FMO नियंत्रण का उपयोग कर चरण 3.4.2 और 3.4.3, क्रमशः में उल्लिखित हैं ।
सभी cTfh कक्षों को CD4+ CXCR5+ CD45RA–के रूप में परिभाषित किया गया है । विशेषता Tfh सक्रियण मार्कर पीडी-1 की अभिव्यक्ति का स्तर तब पीडी-1–, पीडी-1+ या पीडी-1हाय cTfh कोशिकाओं के सबसेट की पहचान करने के लिए निर्धारित किया जा सकता है । फिर, chemokine रिसेप्टर्स CXCR3 और CCR6 का एक संयोजन है, जो अंतर पारंपरिक Th1, 2 या 17 कोशिकाओं द्वारा व्यक्त कर रहे हैं का उपयोग कर, cTfh cTfh1 के रूप में विशेषता जा सकता है, 2 या 17-CXCR3 की एकप्रोफ़ाइल द्वारा की तरह+ CCR6-, CXCR3– CCR6- , और CXCR3– CCR6+, क्रमशः ।
हमारी प्रयोगशाला द्वारा प्रयुक्त एंटीबॉडी पैनल 1 तालिकामें प्रदर्शित किया जाता है । उपयोगकर्ता उनके fluorophore चयन उनके स्थानीय प्रवाह cytometer पर उपलब्ध लेज़र और प्रकाश फ़िल्टर कॉन्फ़िगरेशन के लिए खाते के लिए अनुकूलित करने के लिए पड़ सकता है ।
निंनलिखित विचार fluorophores की पसंद को प्रभावित करते हैं । जहां संभव हो उज्ज्वल fluorophores का प्रयोग करें । विशेष रूप से, dimms (कम अत्यधिक व्यक्त) मार्करों पर प्रतिभाशाली उपलब्ध fluorophores का उपयोग करें । dimmer मार्करों पीडी-1, CXCR3 और CCR6, और एक हद तक कम करने के लिए, CXCR5 शामिल हैं । हम विशेष रूप से नई बीबी, बी. वी. और BUV fluorophores जो उत्कृष्ट चमक प्रदान करते है और इस प्रकार कोशिकाओं की अलग आबादी का आसान समाधान सक्षम का उपयोग किया ।
वर्णक्रमीय ओवरलैप को कम करने के लिए जितना संभव हो और इस प्रकार मुआवजे के स्तर की आवश्यकता के रूप में उत्सर्जन स्पेक्ट्रा भर में fluorophore चयन फैलाओ । एक मुक्त, ऑनलाइन उपकरण है कि एक प्रवाह cytometry पैनल डिजाइन की सहायता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है यहां पाया जा सकता है: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer । उत्सर्जन स्पेक्ट्रम पर अंतरिक्ष को बचाने के लिए, हम एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य कि APC-H7 के साथ ओवरलैप के साथ एक व्यवहार्यता डाई का उपयोग करके एक “डंप चैनल” नियोजित (संयुग्मित करने के लिए CD45RA) का पता लगाने (और अपवर्जन) दोनों मृत और/या CD45RA+ का उपयोग कर सक्षम करने के लिए एकल डिटेक्टर ।
यहां, एक प्रोटोकॉल परिधीय रक्त CD4 के अलगाव के लिए प्रस्तुत किया जाता है+ टी कोशिकाओं और उनके बाद विश्लेषण प्रवाह cytometry द्वारा अलग और हाल ही में प्रसारित उपसमुच्चय वर्णित के अनुपात का निर्धारण करने के लिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल के लिए एक सरल और कारगर तरीका परिधीय रक्त cTfh कोशिकाओं का विश्लेषण का प्रतिनिधित्व करता है, सभी प्रासंगिक साहित्य में पहचान सेट का पता लगाने को सक्षम करने के इस प्रकार अब तक । रक्त के नमूनों क?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
काम ल्यूकीमिया ब्रिटेन से ETB और MJA के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL TECHNOLOGIES | 15062 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17144003 | |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 | BD Horizon | 565223 | |
| BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 | BD Horizon | 563923 | |
| BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 | BD Horizon | 562747 | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone RPA-T4 | BD Horizon | 564419 | |
| PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 | BD Pharmingen | 557946 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone HI100 | BD Pharmingen | 560674 | |
| LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | L34973 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD CompBead | 552843 | |
| FACS Aria II Flow Cytometer | BD Biosciences | 644832 | |
| FACSDiva 6.1.3 | BD Biosciences | 643629 | Flow Cytometer Acquisition Software |
| FlowJo 10.2 | Treestar Inc. | Flow Cytometry Data Analysis Software | |
| Anti-CXCR3 antibody | BD Horizon | 565223 | |
| Anti-CCR6 antibody | BD Horizon | 563923 | |
| Anti-CXCR5 antibody | BD Horizon | 562747 | |
| Anti-CD4 antibody | BD Horizon | 564419 | |
| Anti-PD-1 antibody | BD Pharmingen | 557946 | |
| Anti-CD45RA antibody | BD Pharmingen | 560674 | |
| Viability Marker | ThermoFisher Scientific | L34973 |
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