Isolement des CD4+ T-cellules et analyse de circulation folliculaire T Helper (cTfh) des sous-ensembles de cellules de sang périphérique à l’aide 6-color Flow Cytometry

Résumé

Ici, un protocole pour l’isolement et la caractérisation des CD4⁺ T-cellule sous-ensembles de sang périphérique humain est décrite. Purifiée CD4⁺ T-cellules sont analysés par cytométrie de flux pour déterminer les proportions des sous-ensembles de cellule auxiliaire T-folliculaire.

Résumé

Aberrante activité folliculaire T des cellules d’assistance (Tfh) est détectable dans les maladies auto-immunes et leur présence est associée à des résultats cliniques lorsque le microenvironnement de ganglion lymphatique en cellules B lymphome non hodgkinien-est analysé. Sous-ensembles de circulation les cellules folliculaires-T helper (cTfh), le compartiment mémoire circulant de Tfh cellules dans le sang, sont également perturbées dans la maladie et représentent donc les potentiels nouveaux biomarqueurs prédictifs. Test basé sur sang périphérique est avantageuse car elle est relativement non invasive et permet la surveillance série simple. Cet article décrit une méthode pour isoler les CD4⁺ T-cellules de sang humain et une analyse plus approfondie par cytométrie en flux-énumérer les cellules cTfh et les proportions de leurs divers sous-ensembles (cTfhPD-1^{-/ + / hi}, cTfh1, 2, 17 et cTfh1/17). Le niveau de ces sous-ensembles a ensuite été comparé entre les sujets normaux et de patients atteints de lymphome. Nous avons trouvé que la méthode était assez robuste pour obtenir des résultats fiables de matériel patient systématiquement recueilli. La technique nous décrivons pour l’analyse peut être facilement adaptée à la cellule de tri et d’applications en aval comme la RT-PCR.

Introduction

T-folliculaires cellules auxiliaires (Tfh) sont un CD4⁺ sous-ensemble de cellules T qui était initialement définie dans les tissus lymphoïdes¹. Ces cellules expriment PD-1 et des récepteurs de surface CXCR5, sécrètent IL-21 et IL-4 et show nucléaire expression de BCL-6^2,3, le facteur de transcription. Comme leur nom l’indique, ils sont trouvent dans les centres germinatifs et sont essentielles pour haute affinité anticorps production¹.

Les réponses de Dysregulated Tfh ont été impliqués dans la pathogenèse de la maladie, nota....

Protocole

Des échantillons de sang ont été prélevés des sujets normaux (NS) (n = 12) ainsi que des patients atteints de lymphome (MZL) de la zone marginale (n = 7) et d’autres types de cellules B lymphome non hodgkinien-(BNHL) (FL 6 patients, 2 patients de lymphome lymphoplasmocytique et 1 bas grade B-cellule lymphome non-hodgkinien non précisés patient). Les patients ont été recrutés dans les cliniques d’hématologie à Leicester Royal Infirmary, après avoir donné a informé, le consentement écrit, avec l’approbation éthique mis en place pour toutes les études. Approbation éthique a été obtenue par le Leicestershire, Northamptonshire et Rutland recherche éthique comité 1 référenc....

Résultats

CD4 élevé⁺ pureté a été réalisée en utilisant le CD4⁺ protocole d’isolement, qui était fiable dans l’ensemble de tous les échantillons de sang testé par nos soins (signifie : 96,6 %, SD : 2.38, n = 31) (Figure 3).

Identification du cTfh (CD4⁺ CXCR5⁺ cellules) chez un sujet normal représentatif est présenté (Figure 4A

Discussion

Ce protocole représente un moyen simple et efficace pour analyser les cellules du sang périphérique cTfh, permettant la détection de tous les sous-ensembles pertinentes identifiées jusqu'à présent dans la littérature. Des échantillons de sang peuvent procurer facilement et efficacement comme partie du standards cliniques ambulatoires et des échantillons de la série peut être collecté en parallèle avec les données cliniques. À son tour, cela permet des études prospectives évaluant cTfh sous-ensembles comme biomarqueurs po.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RosetteSep Cocktail d’enrichissement des lymphocytes T CD4+ humains	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Souris anti-humaine CD183  ; Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Souris anti-humaine CD196 (CCR6)  ; Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185)  ; Cloner  ; RF8B2	BD Horizon 562747
BB515 Souris anti-humaine CD4  ; Cloner   ; RPA-T4	BD Horizon	564419
PE souris anti-humaine CD279  ; Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Souris anti-humaine CD45RA Clone  ; HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes rouge lointain fixable, pour excitation 633 ou 635 nm	ThermoFisher Scientific	L34973
Tampon de coloration brillant	BD Horizon	563794
anti-souris Ig, &kappa ;/Negative Control Compensation Particles Set	BD CompBead	552843
FACS Aria II Cytomètre en flux	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Logiciel d’acquisition de cytomètre en flux
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Cytométrie en flux Logiciel d’analyse de données
Anticorps anti-CXCR3	BD Horizon  ;
Anticorps anti-CCR6	BD Horizon  ;
Anticorps anti-CXCR5	BD Horizon  ;
Anticorps anti-CD4	BD Horizon  ;
Anticorps anti--1	BD Pharmingen  ;
Anticorps anti-CD45RA	BD Pharmingen  ;
marqueur de viabilité	ThermoFisher Scientific  ;	N° L34973

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